印度墨水灌注法：一种用于可视化肿瘤结节的染色方法

摘要

来源：Paschall, A. V. 等。一种自发性乳腺癌转移的原位小鼠模型。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了一种称为印度墨水灌注的染色方法，用于定量荷瘤小鼠肺部的肿瘤结节。染色后，肺组织经Fekete溶液固定，以观察肺内的肿瘤结节。

方案

1. 使用印度墨水灌注荷瘤肺组织以验证肺转移灶

注意：为验证荧光素酶活体肿瘤成像结果，应对荷瘤小鼠的肺组织进行印度墨水灌注以定量肿瘤结节数量。4T1细胞亦可转移至其他器官和组织（图1），因此，如需验证肿瘤转移情况，应进行这些器官的组织学检查。本方案以肺转移为例进行说明。

1. 将小鼠保留在其原有的饲养笼中进行安乐死。若与其他动物同笼饲养，需将不进行安乐死的小鼠转移至另一笼中。
2. 移除笼具的过滤盖，更换为CO2过滤盖。打开连接CO2过滤盖的压缩CO2气瓶（100% CO2），调节流速至2 L/min，并持续通入CO2至少10分钟。若10分钟后小鼠仍有呼吸，继续通入CO2直至小鼠停止呼吸后至少1分钟。关闭CO2气瓶阀门及流量计。再等待3分钟，随后取下过滤盖。
3. 将已处死的小鼠仰卧置于聚苯乙烯板上，用针固定四肢以充分暴露气管区域。用70%乙醇喷洒小鼠体表进行消毒。
4. 使用剪刀沿小鼠腹部中线切开，穿过肋骨区域并向上延伸至唾液腺处。观察气管位置，用镊子清除气管周围组织以充分暴露气管。
5. 将移液器吸头从气管下方穿过。一手持吸头，轻轻将气管向上提起并远离身体组织。
6. 将承载小鼠的平台旋转180°。使用½ CC 27 G 1/2规格的结核菌素注射器，经气管向肺部注入印度墨汁（10%印度墨汁和0.1%氢氧化铵），直至肺部完全膨胀并感到明显阻力为止。
7. 使用剪刀剪断气管。用镊子夹住小鼠身体，另一把镊子插入肺部下方，将肺叶完整拉出。将肺组织在盛有水的烧杯中短暂冲洗。
8. 在化学通风橱内，将肺组织转移至含有3 ml Fekete's溶液（50%乙醇、6%甲醛和3%冰醋酸）的玻璃闪烁瓶中。盖紧瓶盖，防止溶液挥发。
   注意：组织可在Fekete's溶液中无限期保存。
9. 数分钟后，可在黑色肺组织上观察到呈白色斑点的肿瘤结节（图1）。白色肿瘤结节肉眼可见。将肺组织转移至通风橱内的培养皿中，计数白色斑点数量。每个白色斑点代表一个独立的转移性肿瘤结节。

结果

图1. 通过印度墨水灌注显影肺部肿瘤结节。 携带肿瘤的小鼠肺组织经印度墨水灌注后，用Fekete溶液固定。白色斑点为肺转移灶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9 mm AutoClip 施夹器	Becton Dickinson 初级医疗诊断部门，斯帕克斯，马里兰州	427630
尖头解剖剪	Fisher	8940
精细尖头镊子	Fisher	8875
70% 乙醇	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 结核菌素注射器	贝克顿·迪金森公司，新泽西州	305620