机械解离：一种从组织中获取活细胞的方法

摘要

来源：Garaud 等., 一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案 J. Vis. Exp. (2014).

本视频介绍了从新鲜人体组织中非酶解离获取活细胞的方法。该技术用于对存在于多种正常及恶性人体组织中的CD45阳性细胞（淋巴细胞/白细胞）进行定性和定量分析。

方案

1. 组织匀浆的制备

1. 解剖来自手术室的切除组织（恶性组织和正常组织）由经过培训的人员在病理实验室进行即时取材。肿瘤组织、癌旁非肿瘤组织（NANT，尽可能取距肿瘤最远的区域）以及正常组织碎片通常在手术切除后1至3小时内，在BSL2级实验室中按照人源组织的标准生物安全操作规程进行处理。本方案的流程图如下所示： 图1.
2. 称重所有组织碎片（正常组织、NANT 和肿瘤组织），并测量其长度、宽度和高度（长度 × 宽度 × 高度）。此步骤对于后续细胞亚群及提取 RNA 的标准化至关重要。 等等。
   注意： 样品尺寸范围为100至10,000 mm³ 尽可能不含脂肪。
3. 将肿瘤碎片印在玻璃载玻片上进行H&E 染色以确认该组织确实属于肿瘤部分。
   1. 通过将一块玻璃载玻片压在肿瘤组织碎片上，并用手指轻轻按压数秒钟来完成此操作。
   2. 用异丙醇固定载玻片 2 分钟，随后用水洗涤。用 Mayer 苏木精对组织复染 30 秒。
   3. 将玻片在六缸水中清洗。用2%伊红B染色15秒。
   4. 用一浴水洗涤，随后用四浴异丙醇洗涤，最后再用一浴水洗涤。
   5. 在异丙醇中孵育1分钟，然后沥干。在两份二甲苯中透明化。
   6. 用二甲苯基封片剂封片。观察肿瘤细胞密度（图2).
      注意： 主要地，肿瘤细胞会黏附在印迹载玻片上，而间质细胞、淋巴样细胞或脂肪细胞则很少保留，从而在肿瘤细胞之间留下空隙（图2).
4. 将组织碎片置于含有1 ml化学成分明确的无血清造血细胞培养基（以下简称培养基）的小型培养皿中，在室温下将其切成小块（约1 - 2 mm）²使用无菌手术刀。
5. 将所有物质（组织碎片 + 培养基）转移至机械解离仪C管中。
6. 用巴斯德移液管将2 ml培养基冲洗培养皿和手术刀，然后加入C管中（解离用培养基总体积为3 ml）。
7. 使用机械解离仪的C管程序A.01（最温和的程序）将组织碎片解离成单细胞悬液。将C管放入仪器中，连续运行两次程序（一个循环=25秒）。
   注意： 该均质化程序已建立并验证适用于人乳腺组织，其他肿瘤或组织类型可能需要使用不同的程序，应首先进行测试。
8. 从装置上取下C管，将匀浆液直接倾入置于50 ml离心管上的40 μm细胞筛网。使用与之前相同的巴斯德吸管继续操作 步骤1.6将C管中残留的任何液体转移至细胞筛。
9. 使用1 ml微量移液器吸头将过滤后的液体转移至15 ml离心管中。暂时保留细胞滤网及其配套的50 ml离心管。
10. 用额外的 3 ml 培养基冲洗 C 管，并使用与之前相同的巴斯德吸管将液体转移 步骤1.6将未均质化的组织中残留的液体尽可能多地挤出，方法是用一支干净的巴斯德吸管或1 ml吸头在仍置于50 ml离心管上的细胞滤筛中轻轻搅动，使液体流入离心管。操作后立即将吸管或吸头丢弃，以避免污染流出液。
11. 将细胞滤网倒置在原始的C管上，用3 ml培养基冲洗，使未均质化的组织重新落入C管中。
12. 同前重新匀浆 步骤1.7 A.01 程序循环两次。
13. 将第二次制备的匀浆液通过置于50 ml离心管上的细胞筛过滤，再用3 ml培养基冲洗C管（同前） 步骤 1.10）并用巴斯德吸管将液体转移至置于50 ml离心管上的细胞筛中，再次挤压细胞筛中残留的结缔组织，尽可能挤出最大量的液体。
14. 此时，15 ml 离心管中体积约为 2.5 ml，50 ml 离心管中体积约为 9 ml。

2. 组织上清液与细胞的分离

1. 将15 ml和50 ml离心管中的匀浆在室温下以600 × g离心15分钟。
2. 将15 ml管中的上清液（SN）倒入洁净的离心管中，并暂时保存于4 °C。此上清液 = 原发肿瘤、NANT或正常组织上清液（终体积2.5 ml），在-80 °C保存前需进一步澄清并分装（见下文）以用于后续分析。
3. 弃去50 ml管中的上清液。
4. 用终体积1 ml培养基轻轻重悬两个细胞沉淀。简而言之，首先通过轻敲离心管至硬表面的方式轻轻打散两个管中的细胞沉淀；用500 µl培养基重悬50 ml管中的松散细胞沉淀，并将此细胞悬液转移至15 ml管中以重悬第二个沉淀。再用另外500 µl培养基重复此步骤一次，以最大程度回收细胞。
5. 取10 µl细胞悬液转移至小离心管中，加入10 µl台盼蓝（1:1稀释），使用血细胞计数板计数活细胞数量。
   注意： 此时也可取部分细胞悬液进行流式细胞术分析，以评估细胞大小、颗粒度，以及根据需要检测少量亚群标记物，从而在进行深入分析或实验前更精确地评估匀浆中细胞的相对分布情况。所有流式细胞术分析均包含CD45标记，用于亚群归一化。
6. 在室温下以300 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。来自肿瘤、NANT或正常组织的细胞现可进行进一步纯化或分析。这些后续步骤最好在手术当天完成。
   注意： 对于流式细胞术分析（但不适用于细胞分选），在抗体标记后应裂解残留的红细胞：向细胞沉淀中加入0.4 ml红细胞裂解缓冲液，立即涡旋1秒，并在室温下避光孵育至少10分钟，然后进行分析。

3. 组织上清液的澄清

1. 将含有组织上清液（SN）的1.5 ml离心管在4 °C条件下以15,000 × g离心15分钟。
2. 小心移除上清液，避免接触或扰动沉淀。根据所需分装的数量和体积，转移至干净的离心管（或多个离心管）中。
3. 将上清液于-80 °C保存，以备后续使用。

结果

图1：实验方案流程图。 本流程展示了我们处理新鲜人组织的方法，以及随后可用于评估浸润人组织淋巴细胞的一些分析方法。

图2：乳腺肿瘤组织印片的H&E染色图像。 该印片取自新鲜的乳腺肿瘤组织碎片，显示了肿瘤细胞的存在，其中空白区域表示未成功转移的部位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GentleMacs 组织解离仪 	Miltenyi Biotec	 130-093-235	 BD Medimachine 在某种程度上是等效的
Centrifuge 5810 R 	Eppendorf 		或其他标准台式离心机
Centrifuge 5417 R 	 Eppendorf		或其他标准微量离心机
Esco 二类 A2 型生物安全柜  	ESCO 全球		或其他标准的BSL2生物安全柜
倒置显微镜 	尼康Eclipse TS100		 或适用于血细胞计数板的其他显微镜
Bürker 培养皿 Marienfield  		640210	或其他标准血细胞计数板
Navios 流式细胞仪 	贝克曼库尔特		 或其他流式细胞仪（推荐 8-10 色）
GentleMacs C-Tube   	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine 使用 Filcon
细胞培养皿  	Sarstedt	72,710	或其他无热原塑料器皿
一次性手术刀   	Swann-Morton	510	或标准一次性无菌手术刀
BD 细胞筛 40 µm   	贝克顿·迪金森	734-0002	或其他非致热性塑料器皿
BD Falcon 50 ml 离心管   	Becton Dickinson	352070	或其他非致热原性塑料器皿
BD Falcon 15 ml 离心管  	Becton Dickinson	352097	 或其他非热原性塑料器皿
BD FACS 管 5 ml  	 Becton Dickinson	352008	或其他无热原塑料制品
无菌巴斯德吸管 5 ml   	VWR	612-1685	或其他非致热原性塑料器皿
1.5 ml 微量离心管   	Eppendorf	7805-00	或其他非致热性塑料器皿
X-Vivo 20   	Lonza	BE04-448Q	推荐使用无血清培养基
磷酸盐缓冲液   	Lonza	BE17-516F	标准生理磷酸盐缓冲液（PBS）
台盼蓝   	VWR	17942E	或其他活性染料