机械解离:一种从组织中获得活细胞的方法

1. 组织匀浆的制备

1. 解剖切除的组织（从手术室切除的恶性和正常组织）由训练有素的人员在病理学实验室立即取走。在 BSL2 实验室中，使用人体组织的标准生物安全程序，在手术切除后 1 - 3 小时内常规处理肿瘤、NANT（尽可能远离肿瘤）和正常组织碎片。该协议的流程图如图 1 所示。
2. 称量所有组织碎片（正常、NANT 和肿瘤）并测量长度、宽度和高度（长 x 宽 x 高）。这是随后细胞亚群、提取的 RNA 等正常化的重要步骤<br /> 注意:样品量范围为 100 至 10,000 mm³，如果可能，无脂肪。
3. 将肿瘤片段印记在载玻片上进行 H&E 染色，以验证组织实际上是肿瘤的一部分。
   1. 为此，将显微镜玻璃玻片按压在肿瘤碎片上，然后用手指轻轻按压几秒钟。
   2. 用异丙醇固定载玻片 2 分钟，然后在水中进行洗涤步骤。用 Mayer 苏木精对组织复染 30 秒。
   3. 在六浴水中清洗载玻片。在 2% Phloxine B 中染色 15 秒。
   4. 在一浴水中洗涤，然后用四浴异丙醇清洗，最后用一浴水完成。
   5. 在异丙醇中孵育 1 分钟并沥干。在两次二甲苯浴中清除。
   6. 使用二甲苯基封固剂进行封片。检查肿瘤细胞结构（图 2）.
      注意:主要是，肿瘤细胞粘附在印记的载玻片上 - 基质细胞、淋巴细胞或脂肪细胞很少残留，在肿瘤细胞之间留下空间（图 2）。
4. 在室温下将组织片段放入含有 1 ml 化学成分明确的无血清造血细胞培养基（以下简称培养基）的小培养皿中，并使用无菌手术刀将其切成小块 （~1 - 2 mm²）。
5. 将所有物质（组织碎片 + 培养基）转移到机械解离器 C 管中。
6. 使用巴斯德移液管用 2 ml 培养基冲洗培养皿和手术刀，并将其添加到 C 管中（用于解离的培养基体积 = 3 ml）。
7. 使用用于 C 管的机械解离程序 A.01（最温和的程序）将组织片段匀浆成单细胞悬液。将 C 管放入设备中，连续运行程序两次（一个周期 = 25 秒><）。 注意:该匀浆程序已针对人类乳腺组织建立并验证，其他肿瘤或组织类型可能需要使用不同的程序，应首先进行测试。
8. 从装置中取出 C 管，将匀浆直接倒入位于 50 ml 管上的 40 μm 细胞过滤器中。使用与步骤 1.6 相同的巴斯德移液器，将 C 管中剩余的任何液体转移到细胞过滤器中。
9. 使用 1 ml 微量移液器吸头将过滤后的液体转移到 15 ml 管中。暂时保留细胞过滤器及其 50 ml 试管。
10. 用另外 3 ml 培养基冲洗 C 管，然后再次使用与步骤 1.6 相同的巴斯德移液器将其转移到仍然位于 50 ml 管上的细胞过滤器中。用干净的巴斯德移液管或 1 ml 吸头轻轻移动过滤器，将捕获在未均质组织中的最大量残留液体挤入 50 ml 管中，然后扔掉，以避免污染洗脱液。
11. 将细胞过滤器倒置在原始 C 管上，并用 3 ml 培养基冲洗，使未均质的组织落回 C 管中。
12. 按照步骤 1.7 中的 A.01 程序的两个周期重新均质化。
13. 将第二个匀浆倒入位于 50 ml 管上的细胞过滤器中，再次用 3 ml 培养基冲洗 C 管（如步骤 1.10 所示），然后用巴斯德移液管转移到位于 50 ml 管上的细胞过滤器上，再次从细胞过滤器中捕获的残留结缔组织中挤出最大量的液体。
14. 此时，15 ml 试管中的体积为 ~2.5 ml，50 ml 试管中的体积为 ~9 ml。

2. 分离组织上清液和细胞

1. 在室温下以 600 x g 的速度将 15 ml 和 50 ml 管中的匀浆离心 15 分钟。
2. 将 SN 从 15 ml 试管倒入干净的试管中，并暂时储存在 4 °C。该上清液=原发性肿瘤、NANT或正常组织SN（最终体积2.5 ml）随后澄清并分装，然后在-80°C下储存以备将来分析（见下文）。
3. 弃去 50 ml 试管中的上清液。
4. 将两个细胞沉淀轻轻重悬于终体积为 1 ml 的培养基中。简而言之，首先轻轻地打破两个试管中的细胞沉淀（通过在坚硬的表面上敲击试管）。将松散的细胞沉淀重悬于 50 ml 和 500 μl 培养基中，并将该细胞悬液转移到 15 ml 试管中以重悬第二个沉淀。对第二个 500 μl 培养基重复此步骤一次，以最大限度地回收细胞。
5. 将 10 μl 细胞悬液转移到一个小管中，与 10 μl 台盼蓝（稀释 1:1）混合，并使用血细胞计数器计数活细胞的数量><。 注意:此时，还可以通过流式细胞术分析细胞悬液的一部分，以评估细胞大小、粒度，如果需要，还可以分析有限数量的亚群标记物，以便在进行广泛分析或实验之前更精确地评估匀浆中的相对细胞分布。流式细胞术的所有分析均包含 CD45 标记，用于亚群的标准化。
6. 通过在室温下以 300 x g 离心 10 分钟来沉淀细胞。来自肿瘤、NANT 或正常组织的细胞现在可以进行进一步纯化或分析。这些额外的步骤最好在手术当天进行。
   注意:对于流式细胞术分析而非细胞分选，抗体标记后应裂解残留的红细胞，向细胞沉淀中加入 0.4 ml 红细胞裂解缓冲液，立即涡旋 1 秒，并在室温下孵育至少 10 分钟（避光）分析前。

3. 组织上清液的澄清

1. 将含有组织SN的1.5 ml试管在4°C下以15,000 x g 离心15分钟。
2. 小心地去除上清液，不要接触或干扰沉淀。转移到干净的试管（或试管）中，具体取决于所需等分试样的数量和体积。
3. 将上清液储存在 -80 °C 以备将来使用。

图 1:协议流程图。显示了我们处理新鲜人体组织的程序和一些随后可用于评估浸润人体组织的淋巴细胞的分析方法。

图 2:乳腺肿瘤组织印记的 H&E 染色图像。该印记取自新鲜的乳腺肿瘤组织碎片，显示肿瘤细胞的存在，其开放空间反映了未转移的区域。