机械解离：一种从组织中获取活细胞的方法

摘要

来源：Garaud 等., 一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案 J. Vis. Exp. (2014).

本视频介绍了从新鲜人体组织中非酶解离获取活细胞的方法。该技术用于对存在于多种正常及恶性人体组织中的CD45阳性细胞（淋巴细胞/白细胞）进行定性和定量分析。

方案

1. 组织匀浆的制备

1. 解剖来自手术室的切除组织（恶性组织和正常组织）由经过培训的人员在病理实验室进行即时取材。肿瘤组织、癌旁非肿瘤组织（NANT，尽可能取距肿瘤最远的区域）以及正常组织碎片通常在手术切除后1至3小时内，在BSL2级实验室中按照人源组织的标准生物安全操作规程进行处理。本方案的流程图如下所示： 图1.
2. 称重所有组织碎片（正常组织、NANT 和肿瘤组织），并测量其长度、宽度和高度（长度 × 宽度 × 高度）。此步骤对于后续细胞亚群及提取 RNA 的标准化至关重要。 等等。
   注意： 样品尺寸范围为100至10,000 mm³ 尽可能不含脂肪。
3. 将肿瘤碎片印在玻璃载玻片上进行H&E 染色以确认该组织确实属于肿瘤部分。
   1. 通过将一块玻璃载玻片压在肿瘤组织碎片上，并用手指轻轻按压数秒钟来完成此操作。
   2. 用异丙醇固定载玻片 2 分钟，随后用水洗涤。用 Mayer 苏木精对组织复染 30 秒。
   3. 将玻片在六缸水中清洗。用2%伊红B染色15秒。
   4. 用一浴水洗涤，随后用四浴异丙醇洗涤，最后再用一浴水洗涤。
   5. 在异丙醇中孵育1分钟，然后沥干。在两份二甲苯中透明化。
   6. 用二甲苯基封片剂封片。观察肿瘤细胞密度（图2<....

结果

图1：实验方案流程图。 本流程展示了我们处理新鲜人组织的方法，以及随后可用于评估浸润人组织淋巴细胞的一些分析方法。

图2：乳腺肿瘤组织印片的H&E染色图像。 该印片取自新鲜的乳腺肿瘤组织碎片，显示了肿瘤细胞的存在，其中空白区域表示未成功转移的部位。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GentleMacs 组织解离仪 	Miltenyi Biotec	 130-093-235	 BD Medimachine 在某种程度上是等效的
Centrifuge 5810 R 	Eppendorf 		或其他标准台式离心机
Centrifuge 5417 R 	 Eppendorf		或其他标准微量离心机
Esco 二类 A2 型生物安全柜  	ESCO 全球		或其他标准的BSL2生物安全柜
倒置显微镜 	尼康Eclipse TS100		 或适用于血细胞计数板的其他显微镜
Bürker 培养皿 Marienfield  		640210	或其他标准血细胞计数板
Navios 流式细胞仪 	贝克曼库尔特		 或其他流式细胞仪（推荐 8-10 色）
GentleMacs C-Tube   	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine 使用 Filcon
细胞培养皿  	Sarstedt	72,710	或其他无热原塑料器皿
一次性手术刀   	Swann-Morton	510	或标准一次性无菌手术刀
BD 细胞筛 40 µm   	贝克顿·迪金森	734-0002	或其他非致热性塑料器皿
BD Falcon 50 ml 离心管   	Becton Dickinson	352070	或其他非致热原性塑料器皿
BD Falcon 15 ml 离心管  	Becton Dickinson	352097	 或其他非热原性塑料器皿
BD FACS 管 5 ml  	 Becton Dickinson	352008	或其他无热原塑料制品
无菌巴斯德吸管 5 ml   	VWR	612-1685	或其他非致热原性塑料器皿
1.5 ml 微量离心管   	Eppendorf	7805-00	或其他非致热性塑料器皿
X-Vivo 20   	Lonza	BE04-448Q	推荐使用无血清培养基
磷酸盐缓冲液   	Lonza	BE17-516F	标准生理磷酸盐缓冲液（PBS）
台盼蓝   	VWR	17942E	或其他活性染料