软琼脂集落形成实验：一种检测新型化合物对癌细胞增殖影响的方法

摘要

本视频介绍了一种软琼脂集落形成实验，用于检测PADI酶抑制剂和BB-Cl-amidine对乳腺癌致瘤性的体外作用。in vitro。该实验还可用于在基因扰动背景下对细胞转化潜能进行定量评估。

1. 3% 2-羟乙基琼脂糖的制备

2. 底层制备：0.6% 琼脂糖凝胶

将多个 5 ml 和 10 ml 移液器预先放入 37 °C 培养箱中预热，以防止操作过程中琼脂糖在移液器内凝固。
将预先配制的 3% 2-羟乙基琼脂糖溶液瓶盖稍拧松，用微波炉加热 15 秒，然后轻轻摇匀溶液，再继续加热 15 秒。
注意：摇动琼脂糖溶液时需格外小心，因为溶液接触空气后会起泡上升，容易溢出。
若瓶中仍有未溶解的凝胶残留物，可再用微波炉加热数秒直至完全溶解。
在后续操作过程中，将装有琼脂糖溶液的瓶子置于 45 °C 水浴中保温，以防止琼脂糖溶液过早凝固。
将 MCF10DCIS 培养基置于 37 °C 水浴中预热。
注意： MCF10DCIS 培养基成分为 DMEM/F12、5% 马血清、5% 青霉素-链霉素。
使用预热的移液器将 3 ml 3% 琼脂糖溶液转移至一个无菌的 50 ml 离心管中。
立即加入 12 ml 温热的 MCF10DCIS 培养基，并轻轻翻转离心管使琼脂糖与培养基充分混匀。操作过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续克隆计数。
将 2 ml 上述混合液轻轻加入 6 孔细胞培养板的每个孔中，避免产生气泡。
将 6 孔培养板水平放置于 4 °C 条件下孵育 1 小时，使混合液充分凝固。
待混合液完全凝固后，将培养板转移至 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。此时底层琼脂糖层已制备完成，可供使用。

3. 含细胞层的制备：0.3% 琼脂糖凝胶

4. 饲养层的制备：0.3% 琼脂糖凝胶

将预先配制的3% 2-羟乙基琼脂糖溶液放入微波炉中加热15秒，轻轻摇动溶液，再加热15秒。
将琼脂糖溶液瓶置于45 °C水浴中平衡。
将MCF10DCIS培养基置于37 °C水浴中预热。
在50 ml锥形管中，将1 ml 3%琼脂糖溶液与9 ml 预热的MCF10DCIS培养基混合，轻轻颠倒混匀，使琼脂糖与培养基充分混合。避免产生气泡。
用BB-CLA（0 µM（DMSO）或1 µM）处理该混合物。
轻轻将1 ml 该混合物（避免产生气泡）加入已含有底层和软层的6孔培养板的每个孔中。
将6孔培养板水平放置于4 °C的平坦表面上至少15分钟，使混合物凝固。
待饲养层凝固后，将培养板放入37 °C培养箱中。
每周重复一次换液操作，通过在现有饲养层上覆盖1 ml 0.3%琼脂糖/培养基/处理液，为细胞补充新鲜培养基，直至观察到克隆形成。
注意：软层和饲养层中的琼脂非常柔软，因此饲养层提供的营养物质可轻易扩散至含细胞的层中，到达细胞。

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