尾静脉注射：小鼠模型中用于转移性研究的癌细胞接种方法

摘要

来源：Warren et. al.，《联合应用尾静脉转移实验与实时活体成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及肿瘤负荷》。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种通过尾静脉注射将标记的癌细胞注入小鼠模型的技术。我们进一步利用实时成像监测乳腺癌转移灶的形成与生长过程 体内 活体动物成像

方案

1. 标记癌细胞的尾静脉注射

注意：步骤 1.2.4 已针对在同源 BALB/c 小鼠中生长的 4T1 细胞进行了优化。若使用其他癌细胞系和小鼠品系，应首先优化接种的细胞数量以及实验持续时间。

1. 在完全培养基中，将第2步获得的4T1细胞系接种于两块15 cm培养皿中进行扩增，以确保注射当天有充足的细胞可用。
2. 按以下步骤准备用于尾静脉注射的细胞：
   1. 吸除培养基，并用1×PBS冲洗细胞培养皿。
   2. 每块15 cm培养皿加入5 mL胰蛋白酶消化2–5分钟（细胞应可轻松从皿底脱落）。将所有细胞转移至锥形管中，再用足量完全培养基冲洗残留细胞以中和胰蛋白酶，并将冲洗液一并加入同一锥形管中。
   3. 使用自动细胞计数仪计数细胞，确定总细胞数量。
   4. 以122 × g 离心3分钟，吸除上清液，将细胞重悬于1×PBS中至所需浓度。本实验中，每只小鼠尾静脉注射100 μL PBS中的2.5 × 10⁴ 个细胞，因此细胞悬液浓度应调整为2.5 × 10⁵ 个/mL。细胞悬液在注射前需置于冰上保存。
      注意：从胰蛋白酶消化细胞到完成尾静脉注射的时间应控制在约1小时内。
3. 通过尾侧静脉将第1.2.5步的4T1细胞注射至小鼠体内，操作步骤如下：
   1. 在动物实验设施的生物安全柜内，轻轻但充分地倒置离心管或使用1 mL注射器反复吹打，确保细胞均匀重悬。每次向注射器装液前均需确认细胞已充分重悬。
   2. 用1 mL鲁尔锁式注射器吸取细胞悬液，并排出多余气泡。安装一枚½英寸、30号针头，针尖斜面朝上，再次排出气泡。
   3. 将小鼠轻柔地放入啮齿类动物固定器中。
   4. 应能清晰观察到尾侧静脉并使其扩张。若静脉不明显，可轻轻夹住尾根部，并将尾巴浸入温水中以促进静脉扩张。
      注意：也可通过将小鼠笼置于加热灯下和/或加热垫上来实现静脉扩张。
   5. 使用酒精棉片清洁尾巴。将针头斜面朝上刺入尾静脉，缓慢注射100 μL细胞悬液。
      注意：若针头正确进入静脉，应可轻松前后滑动，推动针栓时无明显阻力。成功注射后，静脉的蓝色区域会短暂变白，即出现"冲洗"现象。
4. 缓慢拔出针头，并用无菌纱布按压注射部位以止血。
5. 将小鼠放回笼中，观察15分钟以确保其完全恢复。此后应每周三次检查小鼠是否有疼痛或不适表现。
6. 使用活体动物成像系统监测小鼠转移灶的形成与生长情况，持续3–6周（具体时间取决于细胞系和小鼠品系），详见步骤1.5和1.6。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5% 胰蛋白酶	Gibco	15090-046	组织培养用胰蛋白酶
酒精棉片			尾静脉注射前对注射部位进行消毒
BALB/C小鼠（雌性，6周龄）	Taconic	BALB-F	尾静脉转移定植与负荷检测
杜尔贝科&磷酸盐缓冲液	Himedia	TS1006
EDTA	VWR	97061-406	用于稀释组织培养用胰蛋白酶
FBS 100% 美国来源	VWR	97068-085	完全培养基的组分
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	完全培养基的组分
小鼠乳腺癌细胞 4T1	卡曼诺斯癌症研究所	Aslakson, CJ 等，1992	小鼠转移性乳腺癌细胞系
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	完全培养基的组分