循环肿瘤细胞免疫荧光检测：一种表征循环肿瘤细胞的技术

摘要

来源：Garcia, J.，等。通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数 J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了循环肿瘤细胞（CTC）免疫荧光检测技术，该技术用于表征非小细胞肺癌患者样本中循环肿瘤细胞上的生物标志物。该检测可用于监测肿瘤及免疫反应的动态变化，这些变化可能反映患者对化疗、放疗以及潜在的免疫治疗的响应情况。

方案

1. 免疫荧光染色

1. 使用带有血细胞计数板型网格的计数板，在计数室中测定每毫升的细胞数量。用0.2%防粘附溶液（材料表）稀释富集后的样本，使其浓度达到每次细胞离心100,000个细胞/100 µL。
2. 用棉签（材料表）蘸取50 µL的0.2%防粘附溶液润湿样本室边缘。将一张多聚赖氨酸包被的玻片放入样本室内并盖紧。
3. 用移液器吸取并吹打0.2%防粘附溶液3次，以润洗吸头。重悬富集后的样本，并将细胞悬液转移至样本室中。使用专用离心机（材料表）在400 rpm条件下离心4分钟（低速加速）。
4. 在沉积区域周围放置硅胶隔离圈。将玻片置于生物安全柜中干燥2分钟。
5. 通过将1 mL的16%多聚甲醛（PFA）与3 mL无菌PBS混合，配制固定液。每个样本加入100 µL固定液（4% PFA），室温孵育10分钟。移除固定液后，用200 µL PBS洗涤三次，每次室温孵育2分钟。
   注意： 使用PFA时应在化学安全柜内操作，以防吸入。
6. 在无菌PBS中配制封闭液：加入终浓度为5%的胎牛血清（FBS）、5%的Fc受体（FcR）阻断试剂和1%的牛血清白蛋白（BSA）（材料表）。每个样本加入100 µL封闭液，室温孵育30分钟。移除封闭液。
7. 每个样本加入100 µL抗体溶液（CD45抗体1/20；PanCK抗体1/500；PD-L1抗体1/200；Qsp封闭液100 µL）（材料表）。将多聚赖氨酸包被的玻片放入直径100 mm、高15 mm的培养皿中。在吸水纸上加入2 mL无菌水以保持湿度，盖上培养皿盖子。4 °C避光孵育过夜。
8. 移除抗体混合液，用200 µL PBS洗涤三次，每次孵育2分钟。让样本避光干燥5分钟。在沉积区域滴加10 µL封片液（材料表），加盖显微镜盖玻片，避免产生气泡。用指甲油密封盖玻片边缘。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	抗粘附溶液。储存条件：室温
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	带棉垫的样品室。储存条件：室温
Shandon Cytopsin4 离心机	ThermoFisher	A78300003	专用离心机。储存条件：室温
多聚甲醛 16%	ThermoFisher	11490570	固定液。储存条件：+4°C
磷酸盐缓冲液超纯级 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	储存条件：室温
FCR封闭剂	Miltenyi Biotec	130-059-901	储存条件：+4°C
PD-L1 单克隆抗体（克隆号 29E2A3）- 藻红蛋白标记	BioLegend	BLE329706	储存条件：+4°C
全角蛋白单克隆抗体（克隆号 AE1/AE3）Alexa Fluor 488 标记	ThermoFisher	53-9003-80	储存条件：+4°C
CD45 单克隆抗体（克隆号 HI30）Alexa Fluor 647 标记	BioLegend	BLE304020	储存条件：+4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	封片液。储存条件：室温
培养皿	Dutscher	632180	储存条件：室温
磷酸盐缓冲液（PBS）	Ozyme	BE17-512F	储存条件：+4°C
多聚赖氨酸载玻片	ThermoFisher	J2800AMNZ	储存条件：室温
硅胶隔离器	Grace bio-Labs	664270	储存条件：室温
无菌去离子水 – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	储存条件：室温
胎牛血清（FCS）	Gibco	10270-106	储存条件：+4°C