来源：Van den Bijgaart R.J.E. 等人， 离体 活体成像肺转移及其微环境, 视频实验杂志 (2016)
本视频介绍了一种用于离体活体成像的肺组织制备方法，通过琼脂糖灌注来研究癌细胞与间质细胞之间的相互作用。在示例方案中，先描述了琼脂糖灌注步骤，随后进行活细胞相互作用的观察。
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方法文章
全肺琼脂糖灌注膨胀：一种用于肺组织离体活体成像的制备方法
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 肺组织的制备 离体 活体成像
注意：请尽量无菌且谨慎操作，以避免对肺部免疫细胞造成不必要的刺激。
- 按照IACUC批准的动物实验方案，向小鼠腹腔（i.p.）注射过量麻醉剂以实施安乐死。 例如，2.5% 戊巴比妥钠溶液 1 ml。等待小鼠呼吸停止，并对有害刺激（如后肢足垫捏压）完全无反应。
注意： 应避免采用颈椎脱位和二氧化碳安乐死，因为这些方法可能对肺细胞活力产生不利影响。 - 将小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇消毒小鼠。
- 使用手术剪首先在皮肤上做一条横向的上腹部切口，随后在腹膜上做类似的切口。将解剖板保持垂直位置，剪断降主动脉，使血液积聚在腹腔内而非胸腔内。
- 在膈肌上剪开一个小口以释放负压。沿第10至第12肋骨剪开，切除膈肌，以获得对肺部的可视通路。
- 使用手术剪沿胸骨上方剪开皮肤至气管处，但保持肋骨完整。将皮肤与肋骨分离。仔细剥离气管周围结缔组织以暴露气管，注意避免损伤气管本身（图1A).
- 在暴露的气管上，平行于软骨环，尽可能靠近喉部，剪开一个直径约1毫米的小开口（图1B注意不要完全切断气管。
- 取一支20 G针头，轻轻将针头插入气管4-5 mm，无需施加对抗力图1D）。针头的末端应通过气管可见（图1C）。使用镊子将气管内的针头固定。或者，也可用缝合线围绕气管打结，以固定针头位置。
注意： 插入过深可能会损伤气管隆突，或导致仅一侧肺部通气。 - 用注射器吸取400 µ第37页，共l页 °C 2% 低熔点琼脂糖（直接取自恒温水浴）。确保解剖板竖直放置，通过针头将温热的琼脂糖缓慢注入肺部，使用约 400 µl 以膨胀肺部。
注意： 观察肺部在肋骨内的膨胀过程。切勿过度充气，以免肺组织破裂。 - 肺部充气后，填充约~⅔ 肋骨笼的，取下注射器但保持针头留在气管内，以防止琼脂糖泄漏。
- 倒入约 50 ml 的 20 °用 PBS 覆盖膨胀的肺组织，使肺内的琼脂糖凝固。缓慢拔出针头，并用镊子夹闭气管，防止未凝固的琼脂糖泄漏。
- 通过胸骨切开术暴露肺脏，随后切除肺组织。切除肺脏时，夹住气管并完全剪断。轻轻上提气管，边牵拉肺组织出胸腔，边剪除周围结缔组织和食管，直至将肺脏完全从鼠体分离。图1E).
- 将肺组织浸入温热的RPMI-1640培养基中以洗去多余血液，并使用剪刀和镊子在肺门处剪断各肺叶的主支气管，轻柔分离肺叶图1F).
- 将脑叶平面向下放置，以最大化成像表面，置于24孔成像板的一个孔中（图1G。加入100 µ第 37 页，共 l 页 °在小叶上方加入 C RPMI-1640 培养基。将数个直径为 15 mm 的圆形显微镜盖玻片置于小叶上方，以防止其漂浮。
- 将预热的PBS加入周围孔中，以防止RPMI-1640培养基蒸发。将24孔板放入已平衡的气候舱中，并将肺叶维持在37 °C，含空气和5% CO₂2将气候室安装在共聚焦显微镜的载物台上。
注意： 其他气体混合物（例如，5% O₂）2，5% CO2 在 N2 在低氧条件下研究细胞行为的方法也可予以考虑。
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结果
图1. 用于活体成像的肺组织制备流程图。 (A) 小鼠处理完成后暴露气管。(B) 在暴露的气管上沿软骨环方向做一小切口。(C) 将20 G针头插入气管内4–5 mm。(D) 向肺内灌注400 µl 2%低熔点琼脂糖。(E) 将膨胀后的肺组织从小鼠体内分离。(F) 肺叶在充胀后分离。(G) 将肺叶置于24孔成像板的孔中。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂 | NA | NA | 经IACUC批准用于麻醉和/或安乐死的麻醉剂 |
| PBS，USP无菌 | Amresco INC | K813-500ML | 超纯级，用于静脉注射 |
| 1X PBS | UCSF细胞培养中心 | NA | |
| 泡沫塑料平台 | NA | NA | 用作解剖板 |
| 精细锐利剪刀 | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| 20 G × 1 针头，短斜面 | BD | 305178 | |
| 镊子 | Roboz外科器械商店 | RS-5135 | |
| 无针头1 mL注射器 | BD | 309659 | |
| 低熔点温度琼脂糖 | Lonza | 50111 | 配制10 mL溶液时，称取0.2 g琼脂糖，加入10 mL 1×PBS中，加热溶解。琼脂糖在室温下会凝固，因此使用前应置于37 °C水浴中保温。 |
| 不含酚红的RPMI-1640培养基 | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24孔成像板 | E&K scientific | EK-42892 | |
| 玻璃盖玻片，15 mm | 费舍尔科技 | 22-031-144 | |
| 数字CO2和温度控制器 | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| 气候箱 | Okolab | NA | http://www.oko-lab.com |
| Cell Observer旋转盘共聚焦显微镜 | Zeiss | NA | |
| 空气 | UCSF | NA | |
| 氧气 | UCSF | NA | |
| 二氧化碳 | UCSF | NA |
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