全肺琼脂糖灌注膨胀：一种用于肺组织离体活体成像的制备方法

摘要

来源：Van den Bijgaart R.J.E. 等人， 离体 活体成像肺转移及其微环境, 视频实验杂志 (2016)

本视频介绍了一种用于离体活体成像的肺组织制备方法，通过琼脂糖灌注来研究癌细胞与间质细胞之间的相互作用。在示例方案中，先描述了琼脂糖灌注步骤，随后进行活细胞相互作用的观察。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 肺组织的制备 离体 活体成像

注意：请尽量无菌且谨慎操作，以避免对肺部免疫细胞造成不必要的刺激。

1. 按照IACUC批准的动物实验方案，向小鼠腹腔（i.p.）注射过量麻醉剂以实施安乐死。 例如，2.5% 戊巴比妥钠溶液 1 ml。等待小鼠呼吸停止，并对有害刺激（如后肢足垫捏压）完全无反应。
   注意： 应避免采用颈椎脱位和二氧化碳安乐死，因为这些方法可能对肺细胞活力产生不利影响。
2. 将小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇消毒小鼠。
3. 使用手术剪首先在皮肤上做一条横向的上腹部切口，随后在腹膜上做类似的切口。将解剖板保持垂直位置，剪断降主动脉，使血液积聚在腹腔内而非胸腔内。
4. 在膈肌上剪开一个小口以释放负压。沿第10至第12肋骨剪开，切除膈肌，以获得对肺部的可视通路。
5. 使用手术剪沿胸骨上方剪开皮肤至气管处，但保持肋骨完整。将皮肤与肋骨分离。仔细剥离气管周围结缔组织以暴露气管，注意避免损伤气管本身（图1A).

结果

图1. 用于活体成像的肺组织制备流程图。 (A) 小鼠处理完成后暴露气管。(B) 在暴露的气管上沿软骨环方向做一小切口。(C) 将20 G针头插入气管内4–5 mm。(D) 向肺内灌注400 µl 2%低熔点琼脂糖。(E) 将膨胀后的肺组织从小鼠体内分离。(F) 肺叶在充胀后分离。(G) 将肺叶置于24孔成像板的孔中。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉剂	NA	NA	经IACUC批准用于麻醉和/或安乐死的麻醉剂
PBS，USP无菌 	Amresco INC 	K813-500ML 	超纯级，用于静脉注射
1X PBS 	UCSF细胞培养中心	NA
泡沫塑料平台	NA	NA	用作解剖板
精细锐利剪刀  	Fine Science Tools	14060-11
20 G × 1 针头，短斜面 	BD 	305178
镊子  	Roboz外科器械商店	RS-5135
无针头1 mL注射器 	BD 	309659
低熔点温度琼脂糖 	Lonza 	50111	配制10 mL溶液时，称取0.2 g琼脂糖，加入10 mL 1×PBS中，加热溶解。琼脂糖在室温下会凝固，因此使用前应置于37 °C水浴中保温。
不含酚红的RPMI-1640培养基 	Life Technologies 	11835-030
24孔成像板 	E&K scientific	 EK-42892
玻璃盖玻片，15 mm 	费舍尔科技 	22-031-144
数字CO2和温度控制器 	Okolab 	DGTCO2BX 	http://www.oko-lab.com
气候箱 	Okolab 	NA	http://www.oko-lab.com
Cell Observer旋转盘共聚焦显微镜	 Zeiss	NA
空气 	UCSF 	NA
氧气	UCSF 	NA
二氧化碳	UCSF 	NA