肺癌细胞的三维培养：一种研究细胞-基质相互作用的方法

摘要

来源：Chen, S. 等 用于模拟肺鳞状细胞癌进展的多维共培养系统。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了肺癌细胞三维培养的技术，用于研究细胞与细胞外基质之间的相互作用。在该实验方案中，我们将对TUM622肺癌细胞进行三维培养，以探究其在体外形成类器官的潜力。

方案

1. 二维培养中 TUM622 细胞的传代与培养

1. 将TUM622细胞的3D培养基和细胞解离试剂（见 材料表）在37 °C预热。
2. 当TUM622细胞在2D培养瓶中达到80%融合度时进行传代。通常在上一次传代后1周发生。
3. 弃去T75培养瓶中的旧培养基，并用6 mL HEPES缓冲液洗涤一次。避免将液体直接吹打到细胞上。
4. 吸除HEPES缓冲液。加入4 mL胰蛋白酶/EDTA（0.25 mg/mL，见 材料表）快速冲洗，随后弃去胰蛋白酶/EDTA。
5. 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA，在37 °C孵育5分钟。将培养瓶从孵箱中取出，轻敲培养瓶使细胞松动（避免产生气泡），然后将培养瓶放回孵箱继续孵育5分钟。
   注意：长时间暴露于胰蛋白酶会不可逆地损伤细胞并改变其表型，因此建议尽量缩短细胞接触胰蛋白酶的时间。
6. 在光学显微镜下（4倍或10倍物镜）确认细胞已脱离并充分解离。加入4 mL中和缓冲液（TNS缓冲液）（见 材料表中的传代试剂信息），随后加入10 mL 3D培养基（见 材料表）。
7. 使用10 mL移液器轻轻吹打数次以进一步解离细胞，将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。
8. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
9. 在20 mL 3D培养基中每T75培养瓶接种0.8 x 10⁶ 个细胞（见 材料表）。
10. 每隔一天换液一次，更换一半的旧培养基为新鲜培养基。

2. 在细胞外基质中接种 TUM622 细胞以进行三维培养

1. 实验前一天，将基底膜基质小瓶置于4 °C冰箱中过夜解冻。将塑料移液器（2 mL）和枪头于-20 °C预冷过夜。
   注意：并非所有批次的基底膜基质均具有相同的TUM622细胞三维生长支持能力。因此，有必要采购并测试多个批次的基底膜基质，以筛选出能够有效支持腺泡结构形成的批次。通常，此类基质需要较高的蛋白浓度（16–18 mg/mL）。
2. 实验当天，将3D培养基、HEPES缓冲液、胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白酶中和缓冲液（TNS）置于37 °C水浴中预热。在准备培养前立即从冰箱中取出已解冻的基底膜基质，并将小瓶置于冰上。
3. 将组织培养板放置于置于冰上的金属冷却平台进行预冷。将离心管置于冰上的金属冷却架上预冷。
4. 使用来自步骤1.7的TUM622细胞，计算铺板所需的细胞数量。通常每24孔板每孔需要15,000–300,000个细胞。较低密度适用于成像和定量分析，而较高密度则更适合用于RNA提取或Western印迹实验时收集细胞。
5. 将细胞悬液转移至预冷的离心管中（每管包含用于三复孔铺板的细胞），在4 °C条件下，使用水平转子离心机以300 x g 离心5分钟。
6. 使用连接无滤芯枪头（20 µL）的抽吸移液器小心吸除上清液，保留约100 µL培养基在管内（可参考管壁刻度作为参考）。
7. 轻轻敲击管壁侧面，使细胞沉淀松动并充分解离，随后将离心管放回冷却架上。
8. 使用预冷的2 mL移液器，在保持小瓶始终接触冰的条件下，通过上下吹打数次轻柔混匀基底膜基质。吹打时应保持均匀且适中的速度，避免在此过程中引入气泡。
9. 将适量体积的基质转移至各离心管中。若在24孔板中进行三复孔铺板，则每管加入1.1 mL基底膜基质。
10. 使用预冷的枪头，将每管中的基质上下吹打约10次，以形成均匀的细胞悬液。
11. 将310 µL细胞/基质悬液转移至预冷的24孔板的每个孔中。移液器应垂直于板面（90°角），并将悬液加至孔中央。悬液应自然铺展并覆盖整个孔底，无需倾斜培养板。
12. 为便于后续免疫荧光分析，可将细胞/基质悬液平行接种至2孔板腔载玻片中。将100 µL细胞/基质悬液加至2孔板腔载玻片任一孔的中央（参见 材料表），以形成体积更小、呈圆顶状的基质结构。
13. 将培养板和腔载玻片放回组织培养孵箱，孵育30分钟以使基质凝固。在光学显微镜下检查板或载玻片，确认单个细胞在基质中均匀分布（使用4×或10×物镜）。
14. 向每孔中加入1 mL预热的3D完全培养基，向腔载玻片每孔中加入1.5 mL 3D培养基，然后放回孵箱继续培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
支气管上皮细胞生长培养基	Lonza	CC-3170 BEGM
细胞筛，40 µm	ThermoFisher	352340	用于TUM622细胞过滤
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	用于三维培养
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	用于三维培养
Cultrex 三维细胞收获试剂盒	Bio-Techne	3448-020-K
Matrigel（适用于单培养体系）	Corning	356231	用于三维培养
Lab-Tec II 带腔室#1.5 德国盖玻片系统	Nalge Nunc International	155409 (8)	用于三维培养
Lab-Tec II 带腔室#1.5 德国盖玻片系统	Nalge Nunc International	155379 (2)	用于三维培养
ReagentPack 传代培养试剂	Lonza	CC-5034	用于TUM622细胞解离