RNA提取实验：一种从转染miRNA的肺癌细胞中提取RNA的方法

摘要

来源：Hossian, A. K. M. N. 等，联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了从转染了miRNA的肺癌细胞中提取RNA的实验方案。该方法可用于鉴定联合miRNA治疗在阻滞细胞周期和血管生成中的作用。

方案

1. miR-143 和 miR-506 转染

注意：进行所述实验时，须佩戴乳胶手套、防护眼镜和实验服。必要时，应在生物安全柜内操作，开启柜内风扇，且不得阻塞通风口或干扰层流气流。应始终按照制造商说明，将防护玻璃窗调节至适当高度。

1. 在组织培养生物安全柜中，将NSCLC A549细胞接种于T25 cm²培养瓶/6孔板/96孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12K培养基（完全培养基），于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
2. 将miR-143和/或miR-506模拟物，或阴性对照siRNA与转染试剂（2.4 µg miR与14 µL转染试剂混合；参见材料表）在500 µL转染培养基和1.5 mL无血清无抗生素的DMEM/F12K培养基中悬浮，最终miRNA浓度为100 nM。不同细胞系可能需要对miRNA用量和浓度进行优化。可采用的方法包括以递增浓度（如50–200 nM）转染miRNA，并检测目的基因表达的下调情况。
3. 从培养瓶/板中移除完全培养基，用1× PBS洗涤一次。
4. 加入miRNA/阴性对照-转染试剂复合物，在37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时（孵育体积根据培养瓶规格确定）。
5. 更换为4 mL完全培养基，继续培养细胞24小时和/或48小时。
6. 通过胰蛋白酶消化收集转染后的细胞：每个T25 cm²培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育5–10分钟，随后加入3 mL完全培养基终止消化。将每个培养瓶中的细胞悬液转移至标记好的独立15 mL离心管中。操作需在组织培养生物安全柜中进行。
7. 以751 × g离心5分钟，弃上清液。
   注意：弃上清时需小心操作，避免震荡离心管导致细胞丢失。
8. 加入2 mL 1× PBS，以751 × g离心5分钟。
9. 重复步骤7和8一次，以彻底去除残留培养基和上清液。
   注意：此阶段样品可于-80 °C保存，或立即使用。

2. RNA 提取

1. 使用70%异丙醇和RNA酶去污溶液喷洒工作区域进行清洁。
2. 应使用合适的RNA提取试剂盒进行RNA提取（参见材料表）。
3. 从-80 °C取出离心管，使其解冻。加入300 µL裂解缓冲液，上下吹打以破坏细胞膜。
4. 加入等体积的100%超纯乙醇。
5. 充分混匀后转移至分离柱中。
6. 在11至16 × g 条件下离心30秒，弃去穿流液。
7. 加入400 µL洗涤缓冲液，离心以去除缓冲液。
8. 在每个样品中加入5 µL DNA酶I和75 µL DNA消化缓冲液，孵育15分钟。
9. 用400 µL RNA预处理缓冲液洗涤样品。
10. 用RNA洗涤缓冲液洗涤两次。
11. 向柱中加入无核酸酶水，离心后收集RNA。
12. 使用紫外分光光度计测定总RNA浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 非小细胞肺癌细胞	ATCC	ATCC CCL-185
Ambion Silencer 阴性对照 No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
hsa-miR-143-3p miRNA 模拟物	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA 模拟物	ABM	MCH02824
胎牛血清（FBS）	Fisher Scientific	10438026
HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	SH30256FS
DMEM，含 4.5 g/L 葡萄糖，不含丙酮酸钠，含 L-谷氨酰胺	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Invitrogen	10-977-015
Quick-RNA 试剂盒	Zymo Research	R1055
乙醇，绝对（200 证明），分子生物学级	Fisher BioReagents	BP2818500
-80 °C 冰箱	VWR	VWR40086A
Nanodrop	Thermo Scientific	NanoDrop one C
96 孔板	CELLTREAT Scientific	50-607-511
青霉素-链霉素 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
CO2 培养箱	Thermo Scientific	HERAcell 150i
dnase	Zymo Research	E1010
F-12K 营养混合物（Kaighn 改良型），含 L-谷氨酰胺，Corning	Corning	45000-354
胎牛血清 - 优质	Antlanta Biologicals	S11150
温度控制离心机	Thermo Scientific	ST16R
温度控制微量离心机	Eppendrof	5415R