细胞周期分析：研究miRNA转染肺癌细胞中细胞周期调控的方法

摘要

来源：Hossian, A. K. M. N.，等。联合miRNA治疗调控细胞周期和血管生成的分析 J. Vis. Exp. (2019)。

miRNA 或微小RNA是细胞周期进程的关键调控因子。本视频介绍了一种基于流式细胞术的细胞周期分析方法，用于研究转染miRNA的肺癌细胞中miRNA对细胞周期调控的影响。通过阻滞细胞周期进程来抑制细胞增殖，已显示出作为癌症治疗策略的良好前景。

方案

1. miR-143 和 miR-506 转染

注意：进行所述实验时，须佩戴乳胶手套、防护眼镜和实验服。必要时，应在生物安全柜内操作，开启柜内风扇，且不得阻塞通风口或扰乱层流气流。应始终按照制造商说明，将防护玻璃窗调节至适当高度。

1. 在组织培养超净台中，将 NSCLC A549 细胞接种于 T25 cm² 培养瓶/6 孔板/96 孔板中，加入含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F12K 培养基（完全培养基），于 37 °C、5% CO₂ 的组织培养孵箱中过夜培养。
2. 将 miR-143 和/或 miR-506 模拟物，或阴性对照 siRNA 与转染试剂（2.4 µg miR 与 14 µL 转染试剂混合；参见 材料表）在 500 µL 转染培养基和 1.5 mL 无血清无抗生素的 DMEM/F12K 培养基中悬浮，最终 miRNA 浓度为 100 nM。不同细胞系可能需要对 miRNA 用量和浓度进行优化。建议方法包括使用递增浓度的 miRNA（例如 50–200 nM）转染细胞，并检测目的基因的表达下调情况。
3. 从培养瓶/板中移除完全培养基，用 1× PBS 洗涤一次。
4. 加入 miRNA/阴性对照-转染试剂复合物，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 6 小时（孵育体积根据培养瓶规格确定）。
5. 更换为 4 mL 完全培养基，继续培养细胞 24 小时和/或 48 小时。
6. 通过胰蛋白酶消化收集转染后的细胞：每个 T25 cm² 培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 孵育 5–10 分钟，随后加入 3 mL 完全培养基终止消化并收集细胞。将每个培养瓶中的细胞悬液转移至预先标记的 15 mL 离心管中。操作过程需在组织培养超净台中进行。
7. 以 751 × g 离心 5 分钟，弃上清液。
   注意：弃上清时需小心操作，避免震荡离心管导致细胞丢失。
8. 加入 2 mL 1× PBS，以 751 × g 离心 5 分钟。
9. 重复步骤 7 和 8 一次，以彻底去除残留的培养基和上清液。
   注意：此阶段样品可于 -80 °C 保存，或立即使用。

2. 细胞周期分析

1. 每个样品在 T25 cm² 培养瓶中接种 5 × 10⁵ 个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。
2. 转染后24小时和48小时，用胰酶消化法收集细胞。
3. 将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，并正确标记。
4. 在751 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
5. 加入2 mL预冷的1×PBS，涡旋混匀，然后在751 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
6. 用1×PBS重复洗涤一次，以去除残留的培养基。
7. 通过移液加入200 µL预冷的1×PBS，重悬并充分吹打使沉淀完全分散。
8. 在轻轻涡旋的同时，逐滴加入2 mL预冷的70%乙醇，对细胞进行固定。
9. 室温孵育30分钟，随后将离心管置于4 °C环境中1小时。
10. 从4 °C取出离心管，在751 × g 下离心5分钟。
11. 加入2 mL预冷的1×PBS，涡旋混匀，然后在751 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
12. 加入500 µL含碘化丙啶（50 µg/mL）和核糖核酸酶A（200 µg/mL）的1×PBS溶液。
13. 室温避光孵育30分钟。
14. 使用流式细胞仪采集数据。通过前向散射光与侧向散射光（FSC vs. SSC）图选择主要细胞群体，排除FSC与SSC密度图左下角的碎片信号以及图顶部至右上区域的细胞聚集体信号。
15. 使用适当的分析软件对数据进行分析，以鉴定处于细胞周期各阶段的细胞亚群。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含4.5 g/L葡萄糖、不含丙酮酸钠、含L-谷氨酰胺的DMEM培养基	VWR	VWRL0100-0500
优质胎牛血清	Antlanta Biologicals	S11150
胎牛血清（FBS）	Fisher Scientific	10438026
青霉素-链霉素溶液（10/10）	Antlanta Biologicals	B21210
牛胰核糖核酸酶A	Sigma	R6513-50MG
碘化丙啶	MP Biochemicals LLC	IC19545825
分子生物学级无水乙醇（200 proof）	Fisher BioReagents	BP2818500
CO2培养箱	Thermo Scientific	HERAcell 150i
A549非小细胞肺癌细胞	ATCC	ATCC CCL-185
96孔板	CELLTREAT Scientific	50-607-511
FACS Calibur流式细胞仪	Becton Dickinson
Thermo Scientific BioLite细胞培养处理培养瓶	Thermo Scientific	12-556-009
温控离心机	Thermo Scientific	ST16R
温控微量离心机	Eppendorf	5415R
15 mL SpectraTube离心管	VWR	470224-998
Modfit LT	Verity Software		步骤2.15：用于分析细胞周期群体分布的替代分析软件
Fisherbrand Basix带标准扣盖微量离心管	Fisherbrand Basix	02-682-002
hsa-miR-143-3p miRNA模拟物	ABM	MCH01315
hsa-miR-506-3p miRNA模拟物	ABM	MCH02824
含L-谷氨酰胺的F-12K营养混合物（Kaighn改良型）	Corning	Corning 45000-354
–80 °C超低温冰箱	VWR	VWR40086A