$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. miR-143 和 miR-506 转染
注意:在进行所述实验时，请使用乳胶手套、防护眼镜和实验室外套。需要时，在打开柜风扇的情况下使用生物安全柜，不要堵塞气道或干扰层流。始终按照制造商的说明将保护玻璃窗设置到适当的高度。
将 - NSCLC A549 细胞接种在 T25 cm2 培养瓶/6/96 孔板中的补充有 10% FBS 和 1% 青霉素 - 链霉素（培养基）的 DMEM/F12K 培养基中，在组织培养橱中，并在 37 °C 下用 5% CO2 在组织培养箱中孵育过夜。
- 在 500 μL 转染培养基和 1.5 mL 血清和不含抗生素的 DMEM/F12K 培养基中，以 100 nM 的最终 miRNA 浓度悬浮 miR-143 和/或 miR-506 模拟物，或用转染试剂（2.4 μg miR 与 14 μL 转染试剂混合;参见材料表）打乱 siRNA。miRNA 量可能需要针对不同的细胞和浓度进行优化。适当的方法包括用浓度增加的 miRNA（即 50-200 nM）转染细胞，并评估目标基因的表达下调。
- 从烧瓶/板中取出培养基，并用 1x PBS 洗涤一次。
- 加入 miRNA/加扰转染试剂复合物，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 6 小时（培养瓶大小定义增加的孵育体积）。
- 用 4 mL 培养基替换培养基，并将细胞孵育 24 小时和/或 48 小时。
2. 抗体细胞周期微阵列的蛋白表达
- 在 T25 cm2 培养瓶中为每个样品接种 5 x 105 个细胞，并根据第 1 节步骤 1-5 中描述的方案进行转染。
- 24 小时和 48 小时后，通过胰蛋白酶消化收获细胞。
- 将细胞悬液转移至 15 mL 试管中并相应地标记。
- 以 751 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 加入 2 mL 冰冷的 1x PBS，涡旋并以 751 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
- 用 1x PBS 重复洗涤步骤。
- 加入 150 μL 补充有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。轻轻地上下吹打以破坏细胞膜。
- 为防止任何裂解缓冲液干扰，请使用制造商的溶剂交换柱进行缓冲液更换，用标记缓冲液替换裂解缓冲液。
- 用 BCA 测定定量总蛋白。
- 取 70 μg 蛋白质样品并添加标记缓冲液，以达到 75 μL 的最终体积。
- 将 100 μL 二甲基甲酰胺 （DMF） 添加到 1 mg 生物素试剂 （生物素/DMF） 中。
- 向每个蛋白质样品（生物素化蛋白质样品）中加入 3 μL 生物素/DMF，并在 RT 下孵育 2 小时。
- 加入 35 μL 终止试剂，涡旋混合。
- 在 RT 下孵育样品 30 分钟。
- 从冰箱中取出微阵列载玻片，使其在使用前加热至 RT 1 小时。
- 通过将载玻片与 3% 奶粉溶液（在制造商提供的封闭试剂中）在培养皿中孵育，并在室温下连续摇动 45 分钟来进行非特异性结合的封闭。
- 用 ddH2O 水清洗载玻片（除非另有说明，否则用 ddH2O 洗涤）。
- 重复洗涤步骤 ~10 次以完全去除载玻片表面的阻塞溶液。这对于实现均匀和低背景非常重要。
- 去除载玻片表面多余的水，然后继续进行下一步，不要让载玻片干燥。
- 通过将 3% 的奶粉溶解在偶联试剂中来制备偶联溶液。
- 加入 6 mL 偶联溶液和步骤 12 中先前制备的生物素化蛋白质样品的全量。
- 将一张玻片放入供应商提供的偶联室的一个孔中，并向其中添加 ~6 mL 的蛋白质偶联混合物。
注意:确保载玻片完全浸没在蛋白质偶联混合物溶液中。
- 盖上偶联室，在 RT 下孵育 2 小时，并在轨道摇床中连续搅拌。
- 将载玻片转移到培养皿中，并加入 30 mL 的 1x 洗涤缓冲液。将培养皿放入定轨道摇床中，摇动 10 分钟，然后弃去溶液。
- 重复步骤 24 2 次。
- 按照步骤 17 和 18 中的说明，用 ddH2O 水充分冲洗载玻片，并立即进行下一步以避免干燥。
- 在 30 mL 检测缓冲液中加入 30 μL Cy3-链霉亲和素 （0.5 mg/mL）。
- 将玻片放入培养皿中，加入 30 mL 含有 Cy3-链霉亲和素的检测缓冲液。
- 在轨道摇床中孵育 20 分钟，连续摇动避光><。
注意:Cy-3 是一种荧光染料。用铝箔覆盖或在黑暗条件下作以保持荧光强度。
- 执行步骤 24-26，使用温和的气流让载玻片干燥，或将载玻片放入 50 mL 锥形管中，并以 1300 x g 离心 5-10 分钟。
- 将载玻片放入载玻片支架中，并用铝箔盖住。
- 在微阵列扫描仪中用适当的激发和发射波长扫描载玻片。在 Cy3 的情况下，激发波长峰值在 ~550 nm，发射峰在 ~570 nm。
- 分析数据（有关使用的软件，请参阅材料表）。