抗体芯片：一种研究经miRNA处理的肺癌细胞中蛋白质表达的技术

摘要

来源：Hossian, A. 等. 联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了利用抗体微阵列检测特定基因表达，以研究转染miRNA的肺癌细胞中蛋白质表达水平的技术。在本视频展示的实验方案中，我们采用抗体微阵列来鉴定联合miRNA治疗在抑制细胞周期和血管生成中的活性。

方案

1. miR-143 和 miR-506 转染

注意：进行所述实验时，须佩戴乳胶手套、防护眼镜并穿上实验服。必要时，应在生物安全柜内操作，开启柜内风扇，且不得阻塞通风口或干扰层流气流。应始终按照制造商说明，将防护玻璃窗调节至适当高度。

1. 在组织培养超净台中，将 NSCLC A549 细胞接种于含 DMEM/F12K 培养基（添加 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素，即培养液）的 T25 cm² 培养瓶/6 孔板/96 孔板中，于 37 °C、5% CO₂ 的组织培养孵箱中过夜培养。
2. 将 miR-143 和/或 miR-506 模拟物，或阴性对照 siRNA 与转染试剂（2.4 µg miR 与 14 µL 转染试剂混合；参见 材料表）在 500 µL 转染培养基和 1.5 mL 无血清无抗生素的 DMEM/F12K 培养基中悬浮，使最终 miRNA 浓度为 100 nM。不同细胞系可能需要对 miRNA 用量和浓度进行优化。可采用的方法包括以递增浓度的 miRNA（例如 50–200 nM）转染细胞，并检测目的基因表达的下调情况。
3. 移除培养瓶/板中的培养液，用 1× PBS 洗涤一次。
4. 加入 miRNA/阴性对照-转染试剂复合物，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 6 小时（孵育体积根据培养瓶规格确定）。
5. 更换为 4 mL 新鲜培养液，继续培养细胞 24 小时和/或 48 小时。

2. 通过抗体细胞周期微阵列进行蛋白质表达分析

1. 在T25 cm² 培养瓶中，每份样品接种5 × 10⁵ 个细胞，并按照第1节步骤1-5所述方案进行转染。
2. 转染后24小时和48小时，用胰酶消化收集细胞。
3. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并做好相应标记。
4. 在751 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
5. 加入2 mL预冷的1×PBS，涡旋混匀后在751 × g 下离心5分钟，弃去上清液。
6. 用1×PBS重复洗涤一次。
7. 加入150 µL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，轻轻吹打以破坏细胞膜。
8. 为避免裂解缓冲液的干扰，使用厂家提供的溶剂交换柱进行缓冲液置换，将裂解缓冲液更换为标记缓冲液。
9. 采用BCA法测定总蛋白浓度。
10. 取70 µg蛋白样品，加入标记缓冲液使终体积达到75 µL。
11. 将100 µL二甲基甲酰胺（DMF）加入1 mg生物素试剂中（即生物素/DMF溶液）。
12. 向每个蛋白样品中加入3 µL生物素/DMF溶液（生物素化蛋白样品），室温孵育2小时。
13. 加入35 µL终止试剂，涡旋混匀。
14. 室温孵育30分钟。
15. 将微阵列芯片从冰箱中取出，室温平衡1小时后再使用。
16. 在培养皿中加入3%脱脂奶粉溶液（使用厂家提供的封闭试剂配制），将芯片置于其中，在室温下持续振荡孵育45分钟，以阻断非特异性结合。
17. 用ddH₂O洗涤芯片（除非另有说明，后续所有洗涤步骤均使用ddH₂O）。
18. 重复洗涤约10次，彻底去除芯片表面的封闭液。此步骤对获得均匀且低背景信号至关重要。
19. 去除芯片表面多余的水分后立即进行下一步操作，避免芯片干燥。
20. 将3%脱脂奶粉溶解于偶联试剂中，配制偶联溶液。
21. 将6 mL偶联溶液加入第12步中制备的全部生物素化蛋白样品中。
22. 将一张芯片放入厂家提供的偶联室的一个孔中，并加入约6 mL蛋白偶联混合液。
    注意：确保芯片完全浸没在蛋白偶联混合液中。
23. 盖上偶联室，在室温下于旋转摇床中持续振荡孵育2小时。
24. 将芯片转移至培养皿中，加入30 mL 1×洗涤缓冲液，置于旋转摇床上振荡10分钟，弃去溶液。
25. 重复步骤24两次。
26. 按照步骤17和18所述方法，用ddH₂O充分冲洗芯片，并立即进入下一步，防止芯片干燥。
27. 在30 mL检测缓冲液中加入30 µL Cy3-链霉亲和素（0.5 mg/mL）。
28. 将芯片放入培养皿中，加入含Cy3-链霉亲和素的30 mL检测缓冲液。
29. 在旋转摇床上避光振荡孵育20分钟。
    注意：Cy3为荧光染料，需用铝箔包裹或在避光条件下操作，以保持荧光强度。
30. 执行步骤24-26，并通过轻柔气流吹干或将芯片放入50 mL锥形管中在1300 × g 下离心5-10分钟使芯片干燥。
31. 将芯片放入芯片架中，并用铝箔覆盖。
32. 使用微阵列扫描仪，选择适当的激发和发射波长对芯片进行扫描。对于Cy3，激发波长峰值约为550 nm，发射波长峰值约为570 nm。
33. 分析数据（参见 材料表中所用软件）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 非小细胞肺癌细胞	ATCC	ATCC CCL-185
青霉素-链霉素 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
胎牛血清（FBS）	Fisher Scientific	10438026
抗体芯片检测试剂盒，2次反应	Full Moon Bio	KAS02
细胞周期抗体芯片，2张芯片	Full Moon Bio	ACC058
ScanArray Express	PerkinElmer		步骤 2.33：微阵列分析软件
HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	SH30256FS
Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白检测试剂	Thermo Scientific	PI23226
hsa-miR-506-3p miRNA 模拟物	ABM	MCH02824
hsa-miR-143-3p miRNA 模拟物	ABM	MCH01315