小鼠肺组织流式细胞术样品制备：从肺组织制备单细胞悬液用于流式细胞分析

摘要

来源：Moll, H. P., 等。同系肺癌腺癌细胞原位移植研究 PD-L1 表达。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了制备小鼠肺组织单细胞悬液的方法，用于通过流式细胞术分析肺腺癌细胞中PD-L1的表达。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 流式细胞术用肺组织制备

1. 在预定的实验终点，通过皮下注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 体重）混合物使小鼠镇静，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 将尸体浸入70%乙醇中，并用胶带将小鼠固定在解剖板上。
3. 沿腹侧正中线做切口，轻轻翻转皮肤以暴露胸壁肌肉和腹腔器官。穿刺膈肌，并用剪刀剪开肋骨以暴露胸腔。
4. 在左心室剪开一小口以允许血液流出后，使用27 G针头经右心室以6–8 mL冰冻PBS对肺组织灌注3次。肺组织应完全清除血液并变为全白色。
5. 取出肺组织，用剪刀将肺叶剪成小块。将肺组织块转移至2 mL微量离心管中，加入1.5 mL肺组织消化液（RPMI，5% FCS，150 U/mL I型胶原酶，50 U/mL I型DNase），混匀后孵育。
6. 在37 °C条件下孵育肺组织块30–60分钟，并持续震荡。
7. 将肺细胞悬液通过70 µm细胞滤网转移至50 mL离心管中。用无菌10 mL注射器的推杆背面轻压滤网残留物，并用含2% FCS的PBS 15 mL冲洗滤网。
8. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。将细胞重悬于1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，室温孵育5分钟以裂解残留的红细胞。
9. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，将细胞重悬于1 mL含2% FCS的PBS中，随后按照所需的染色方案进行流式细胞术分析。
   注意：也可将细胞重悬于含30% FCS和10% DMSO的RPMI培养基中，使用冻存管进行冷冻保存，以备后续分析使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠肺腺癌细胞系			实验室自建
C57Bl/6 小鼠			可使用两种遗传背景杂交的 F1 代（8–12 周龄）
129S 小鼠
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11544446
胎牛血清	Life Technologies	11573397
青霉素/链霉素溶液	Life Technologies	11548876
L-谷氨酰胺	Life Technologies	11539876
Ketasol（100 mg/mL 氯胺酮）	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol（20 mg/mL 赛拉嗪）	Ogris Pharma	8-00178
钝头镊	Roboz	RS8260
学生用虹膜剪	Fine Science Tools	91460-11
DNase I（无 RNase）	New England Biolabs	M0303S
I 型胶原酶	Life Technologies	17100017
ACK 裂解缓冲液	Lonza	10-548E