免疫荧光检测法：一种用于鉴定捕获在医用导丝上的肿瘤细胞的方法

摘要

来源：Gallerani, G. 等，利用医用导丝捕获循环肿瘤细胞的肿瘤细胞表征：基于免疫荧光与DNA FISH的三维方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了在功能化医用导丝上捕获的循环肿瘤细胞进行免疫荧光染色的技术。这种功能化导丝可直接从患者血液中体内分离循环肿瘤细胞。 

方案

1. 导线上的免疫-DNA FISH

1. 细胞系加标至导线（三维支撑）
   注意：初步准备需根据EpCAM阳性准确选择贴壁细胞系。导线经抗EpCAM抗体功能化处理，因此仅EpCAM阳性细胞会被标记。
   注意：请勿触碰导线的功能化部分，以免造成损伤。
   注意：所有步骤均须在层流罩内无菌条件下进行。
   1. 使用4 mL完全培养基将T75培养瓶（80%融合度）中的全部内容物重悬于5 mL离心管中；单次加标建议使用约2,000,000个细胞，以最大化细胞在导线上的黏附。
   2. 将导线从其玻璃包装中取出。
   3. 将导线的功能化金质部分浸入离心管中，确保导线塞与离心管紧密贴合，不漏水。用实验室封口膜密封。
      注意：建议使用5 mL离心管，以确保导线塞与离心管正确匹配。
   4. 在室温下使用试管旋转仪孵育30分钟（0–120°角度）。
   5. 使用3个不同的洁净离心管，用1× PBS溶液清洗导线三次。
2. 固定与通透
   警告：丙酮为易燃物质，可能刺激呼吸道。仅可使用耐丙酮的塑料或玻璃容器（不可使用PVC或PVDF）。
   注意：这些步骤应在化学通风橱中进行。
   1. 将导线在空气中干燥。
   2. 将导线浸入100%丙酮溶液中，在室温下固定10分钟。使用5 mL离心管。
      注意：导线塞不得接触固定液。
   3. 在室温下空气中干燥5分钟。
      注意：此处可暂停实验流程。导线必须在-20 °C下保存。长期储存时，将导线塞置于功能化端附近，小心将导线插入储存用玻璃管中，注意避免损伤功能化端。盖紧储存玻璃管，并在-20 °C下垂直或水平存放。
3. 免疫荧光第1天
   注意：此阶段需过夜孵育（约16小时）。
   1. 使用5 mL离心管，用1× PBS溶液清洗两次。
   2. 将导线置于抗体稀释缓冲液中，在室温下孵育30分钟，使用5 mL离心管。
   3. 根据说明书，在抗体稀释缓冲液中配制150 µL抗体混合液，单克隆一抗与荧光染料偶联物按指定比例稀释。例如，EpCAM-FITC抗体使用1:20稀释比例。
   4. 使用P200枪头进行孵育操作：将导线从导线塞中取出，轻轻将导线从枪头较大孔端插入。先插入非功能化端，缓慢拉动导线使其穿过较小孔，直至金质部分刚好超出较大孔端。
   5. 轻轻将150 µL抗体混合液（例如1:20稀释的抗EpCAM-FITC抗体）滴入枪头。为避免气泡产生，轻轻旋转导线，直至功能化部分完全浸没。
   6. 密封枪头孔口。可用实验室封口膜包裹孔口以增强密封。
   7. 在4 °C避光条件下垂直孵育过夜（约16小时）。
4. 免疫荧光第2天
   1. 通过用1× PBS清洗导线两次，终止抗体孵育。
   2. 将导线重新插入其导线塞中。
      注意：在5 mL离心管中用1× PBS于4 °C保存，直至进行FISH检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	Carlo Erba	# 414605
吐温20	BIO RAD	# 1706531
PBS（磷酸盐缓冲液）	Medicago	# 09-9400-100
丙酮	Sigma Aldrich	# 534064-500ML
橡胶胶水	Royal Talens	# 95306500
EpCAM-FITC（克隆：HEA-125）	Mitenyi	#130-080-301
RPMI 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	MetaSystems Probes	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Gilupi Nanomedizin		功能化导线
ZEISS 荧光显微镜 Axioskop	ZEISS
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64位软件	Nikon
Nikon DS-QiMc 12位数字相机	Nikon	DS-QiMc