miRNA 提取：一种从血浆样本中提取 miRNA 的方法

摘要

来源：Mensah, M. 等，基于 microRNA 的液体活检：血浆 miRNA 特征分类器（MSC）在肺癌筛查中的应用经验。J. Vis. Exp. (2017)。

microRNA（miRNA）是具有组织特异性的微小非编码RNA，可调控基因表达，有望成为肺癌早期检测的理想候选标志物。在本视频展示的实验方案中，我们将从患者血液样本中分离microRNA，用于肺癌的早期筛查。

方案

1. 血浆样本采集

1. 使用喷雾涂层K₂EDTA的真空采血管收集10 mL全血样本，并在室温下保存。
   注意：为尽量减少溶血，应在2小时内分离血浆。避免将全血储存在低温（例如，4 °C）下，以防热休克和细胞裂解导致非特异性miRNA释放。
2. 在1小时内，通过第一次离心步骤分离血浆，条件为1,258 × g、4 °C离心10分钟。
3. 将血浆上清液转移至15 mL离心管中，注意避免接触淋巴细胞环。
4. 将血浆再次在1,258 × g、4 °C条件下离心10分钟。
5. 将1 mL血浆分装至1.5 mL冻存管中，避免收集管底的血浆部分。
6. 除留出一份用于溶血评估外，其余所有分装样品均应储存在−80 °C。分子分析应在5周内完成。

2. 血浆总RNA提取

1. 配制OMG溶液，每毫升匀浆液中加入20 µL 1-Thioglycerol。由于1-Thioglycerol具有黏性，应小心使用移液器以确保准确量取。使用前将OMG溶液置于冰上或2–10 °C环境中冷却。
   注意： 工作液在 2-10 °C 下可稳定保存 1 个月。
2. 将275 µL无核酸酶水加入DNase I冻干粉瓶中，轻轻混匀（切勿涡旋振荡）以重悬DNase I。为便于观察，向重悬后的DNase I中加入5 µL蓝色染料，并将溶液分装至无核酸酶的离心管中，每管为一次性使用量。将重悬后的DNase I储存于-30 °C至-10 °C。
3. 从200 µL血浆开始，加入200 µL预冷的OMG溶液。
4. 涡旋15-30秒以确保完全均质化。若出现泡沫，将样品置于冰上静置。
5. 向匀浆样品中加入 200 µL 裂解缓冲液和 25 µL 蛋白酶 K，涡旋振荡 20 秒。
6. 在预先加热至 37 °C 的恒温混匀仪中孵育样品 15 分钟。
7. 为每个样本在仪器的托盘上装载一个 cartridge，并将 plugger 置于正确位置。
8. 将裂解液转移至仪器卡盒的相应位置。
9. 向试剂盒的适当位置加入 5 µL DNase I 溶液。
10. 向每个洗脱管底部加入 60 µL 无核酸酶水。
11. 选择 "RSC miRNA 组织" 方法并开始自动纯化程序。总RNA样品可在−80 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Lonza	BE-17-516
20xTE 缓冲液，pH 8.0	Molecular probe	T11493	将20倍浓缩液用无核酸酶水稀释至终浓度为0.1X
无核酸酶水
Maxwell RSC miRNA 组织提取试剂盒	Promega	AS1460	试剂盒包含匀浆液、DNase I、蛋白酶K、裂解缓冲液及提取柱。对于1-硫代甘油，应避免吸入以及与皮肤和眼睛接触。请在通风橱中使用。
Vacutainer 安全锁采血套装	Becton Dickinson	367286-364815
涡旋混合器	Velp Scientifica	F202A0173
ThermoMixer T-摇床	Euroclone	A00564	在开始RNA提取前，将Thermo Mixer预热至37 °C
Maxwell RSC 仪器	Promega	AS4500
1.5 ml 冻存管	Sigma-Aldrich	Z359033