免疫组织化学染色:一种从薄组织切片中获取空间信息的方法

Abstract

来源:Baharom F. et al.， 人肺树突状细胞:使用免疫组织化学和流式细胞术进行支气管内活检的空间分布和表型鉴定。J. Vis. Exp. （2017 年）

该视频介绍了免疫组织化学染色技术，用于从支气管内活检中识别树突状细胞。

Protocol

1. GMA 切片。

1. 用蒸馏水制备 0.05% 氨溶液。将玻璃刀和活检物放入切片机中。通过调整刀架和活检块的角度，小心地将活检块与刀片对齐，使刀片平放在活检块的表面。
2. 使用切片机以缓慢的切割速度切割 2 μm 厚的切片，并使用镊子转移和漂浮在氨水上的切片。将切片漂浮 45-90 秒，允许温和的抗原修复和切片展开。
3. 用显微镜载玻片拾取切片。通过用甲苯胺蓝快速染色来检查活检组织学。
在
4. 设置为 50 °C 的热板上干燥载玻片，并使用塑料巴斯德移液器将 500 μl 过滤的甲苯胺蓝染色剂涂在切片上。加热热板上的部分，直到污渍边缘开始出现一个绿色环，然后用水洗掉。
5. 使用光学显微镜检查活检组织学。用于免疫组化的切片应包含未受损的固有层和上皮的良好区域，腺体和平滑肌尽可能少。
6. 切割具有良好组织学的切片，并用聚 L-赖氨酸包被（PLL 包被）显微镜载玻片拾取它们进行免疫组织化学染色。从每个活检中至少切下两个切片进行分析。干燥玻片至少 1 小时。干燥后，切片可以用锡箔包裹并在 -20 °C 下储存长达 2 周，或者可以立即进行免疫染色。

2. GMA 包埋的支气管内活检的免疫组织化学染色

注:叠氮化钠有毒。在通风橱内制备 0.1% 叠氮化钠溶液，并远离酸。与酸接触放出有毒气体。

1. 使用金刚石笔在切片周围画画，并将载玻片放在染色架上。
2. 进行过氧化物酶阻滞。制备 0.3% 过氧化氢在 0.1% 叠氮化钠溶液中的过氧化物酶封闭溶液。将 1 ml 过氧化物酶块涂在切片上并孵育 30 分钟。
3. 制备 0.05 M Tris 缓冲盐水 （TBS） 的洗涤液，pH 7.6。在 TBS 中洗涤载玻片，3 x 5 分钟。
4. 在 DMEM 中制备 1% BSA 嵌段溶液。提前大体积执行此作，分装并冷冻，直到需要为止。排空载玻片并将切片在封闭溶液中孵育 30 分钟，以阻断非特异性抗体结合。如果仍然存在非特异性结合，则使用与二抗相同物种的 5% 血清阻断剂进行 30 分钟的孵育步骤。
5. 在 TBS 中将一抗（CD45 或 CD1a）稀释至所需浓度（CD45 以 1:1,000 稀释;CD1a 以 1:1,00 稀释）并将其应用于载玻片。盖上切片并在 RT 下孵育过夜。
6. 在 TBS 中洗涤载玻片 3 次。在 TBS 中将生物素化二抗（针对一抗宿主物种，在本例中为兔抗小鼠 F（ab'₂））稀释至所需浓度（1:300 稀释），并将其涂在载玻片上。在 RT 下孵育 2 小时。
7. 使用前至少 30 分钟准备链霉亲和素生物素-过氧化物酶复合物。确保有足够的空间覆盖所有载玻片。在 TBS 中洗涤载玻片 3 次。将溶液涂抹在载玻片上，并在室温下孵育 2 小时。
8. 在 TBS 中洗涤载玻片 3 次。准备 3-氨基-9-乙基咔唑 （AEC） 过氧化物酶底物溶液（根据制造商的说明制备）。将其涂抹在玻片上并孵育 20-30 分钟或直到形成所需的染色强度。
9. 用流动的自来水冲洗玻片 5 分钟，用过滤的 Mayer 苏木精溶液对切片进行复染 2 分钟。用流动的自来水清洗玻片 5 分钟。
10. 排空载玻片并用永久性水性封固剂覆盖切片。在干燥箱中于 80 °C 干燥载玻片。让载玻片冷却，然后用 DPX 安装它们并放置盖玻片。

Materials