免疫组织化学染色：一种从薄组织切片中获取空间信息的方法

摘要

来源：Baharom F. 等，人类肺树突状细胞：利用免疫组织化学和流式细胞术对支气管内活检样本中树突状细胞的空间分布与表型鉴定。J. Vis. Exp. （2017）

本视频介绍了免疫组织化学染色技术，用于从支气管内活检样本中鉴定树突状细胞。

方案

1. GMA 切片。

1. 用蒸馏水配制0.05%氨水溶液。将玻璃刀片和活检组织放入切片机中。通过调节刀架和活检组织块的角度，仔细对齐组织块与刀片，使刀片平整地贴合在组织块表面。
2. 使用切片机以缓慢的切片速度切取2 µm厚的切片，并用镊子将切片转移至氨水中漂浮。漂浮45–90秒，使抗原轻柔暴露并让切片自然展开。
3. 用载玻片捞取切片。用甲苯胺蓝快速染色，检查活检组织的组织学结构。
4. 将载玻片置于50 °C的加热板上干燥，并用塑料巴斯德吸管向切片滴加500 µl过滤后的甲苯胺蓝染液。在加热板上加热切片，直至染液边缘开始出现绿色环状物，然后用水冲洗干净。
5. 在光学显微镜下检查活检组织的组织学结构。用于免疫组织化学的切片应包含完整且未受损的固有层和上皮区域，腺体和光滑肌成分应尽可能少。
6. 切取组织学结构良好的切片，并用多聚-L-赖氨酸包被（PLL包被）的载玻片捞取，用于免疫组织化学染色。每个活检组织至少切取两个切片用于分析。将载玻片干燥至少1小时。干燥后，切片可用铝箔包裹，于-20 °C保存最多2周，或直接进行免疫染色。

2. GMA包埋的支气管内活检组织的免疫组织化学染色

注意：叠氮化钠具有毒性。应在通风橱内且远离酸类物质处配制0.1%叠氮化钠溶液。与酸接触会释放有毒气体。

1. 使用金刚石笔在切片周围划线，并将载玻片放置于染色架上。
2. 进行过氧化物酶封闭。配制含有0.3%过氧化氢和0.1%叠氮化钠的过氧化物酶封闭液。每张切片加入1 ml封闭液，室温孵育30分钟。
3. 配制0.05 M Tris缓冲生理盐水（TBS），pH 7.6。将载玻片在TBS中洗涤，每次5分钟，共洗3次。
4. 在DMEM中配制1% BSA封闭液。提前大量配制，分装后冷冻保存备用。弃去TBS，每张切片加入封闭液，室温孵育30分钟，以阻断非特异性抗体结合。若仍存在非特异性结合，可增加一步使用与二抗同源物种的5%血清封闭液，室温孵育30分钟。
5. 将一抗（CD45或CD1a）用TBS稀释至所需浓度（CD45按1:1,000稀释；CD1a按1:1,00稀释），加至切片上。加盖盖玻片，室温孵育过夜。
6. 将载玻片在TBS中洗涤3次。将生物素标记的二抗（针对一抗宿主物种，本实验中为兔抗小鼠F(ab'₂)）用TBS稀释至适当浓度（1:300稀释），加至切片上，室温孵育2小时。
7. 至少在使用前30分钟配制链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，确保用量足以覆盖所有切片。将载玻片在TBS中洗涤3次后，加入该复合物溶液，室温孵育2小时。
8. 将载玻片在TBS中洗涤3次。按制造商说明配制3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）过氧化物酶底物溶液，加至切片上，室温孵育20–30分钟，或直至达到理想的染色强度。
9. 用流动自来水冲洗载玻片5分钟。用滤过的Mayer苏木精溶液对切片复染2分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。
10. 弃去水分，切片上加永久性水溶性封片剂。将载玻片置于80 °C烘箱中干燥。待冷却后，用DPX封固并加盖盖玻片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GMA 切片
载玻片	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	切边，磨砂端
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	工作液稀释比例 1:10
超薄切片用玻璃条	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	洗涤液（0.1% Tween20）
LKB 7800B 制刀机	LKB
胶囊切割器	TAAB 实验室	C065
碳钢单刃刀片	TAAB 实验室	B054
台钳
氨水，25%	VWR	1133.1	1 L 中加入 2 ml，稀释比例 1:500（0.05%）
切片机	Leica		Leica RM 2165
光源	Leica		Leica CLS 150 XE
带摆臂支架的显微镜	Leica		Leica MZ6
GMA 免疫组织化学
金刚石笔	Histolab	5218
30% 过氧化氢溶液	AnalaR Normapur	23619.264
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
氯化钠	VWR chemicals	27810.295
牛血清白蛋白	Millipore	82-045-2	Probumin BSA 诊断级
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Sigma-Aldrich	D5546
抗人 CD45 抗体	BioLegend	304002	小鼠单克隆抗体，克隆号 HI30，同型 IgG1k。工作浓度 500 ng/ml
抗人 CD1a 抗体 AbD	Serotech	MCA80GA	小鼠单克隆抗体，克隆号 NA1/34-HLK，同型 IgG2a。工作浓度 10 µg/ml
小鼠单克隆 IgG1 同型 对照	Abcam	ab27479
小鼠单克隆 IgG2a 同型 对照	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite 标准试剂盒	Vector Labs	PK-6100
AEC（3-氨基-9-乙基咔唑） 过氧化物酶底物试剂盒	Vector Labs	SK-4200
Mayer 苏木精	HistoLab	1820
永久性水溶性封片 介质	AbD Serotech	BUF058C
干燥烘箱
DPX 永久封片液	VWR	360292F
光学显微镜	Leica		Leica DMLB
显微镜相机	Leica		Leica DFC 320
分析软件	Leica		Leica Qwin V3