外泌体分离：一种从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体的技术 关键词：外泌体，非小细胞肺癌，血浆，分离技术，生物标志物

摘要

来源：Giallombardo, M.，等。通过qPCR对非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA进行分析：一种可行的液体活检工具。J. Vis. Exp. （2016）。

血浆分离的外泌体可作为一种无创且可重复的方法，用于生物标志物的检测和随访，以实现早期发现和疾病进展监测。本视频介绍了从非小细胞肺癌患者血浆样本中分离外泌体的实验方案，该方法可用于后续的DNA和蛋白质提取。

方案

1. 外泌体分离

注意：血浆样本中外泌体的分离采用商业试剂盒，按照生产商提供的方案进行，并添加RNA酶处理步骤：（所有这些步骤必须在佩戴个人防护装备和环境防护设备的情况下进行，并遵循操作生物样本的特定法律程序）。

1. 取每份样品在 -80 °C 下保存的 1 ml 血浆，置于冰上。
2. 在室温下以 2,000 × g 离心 20 分钟 ；此步骤为必需操作，以去除细胞和碎片。
3. 将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。
4. 将新离心管在室温下以 10,000 × g 离心 20 分钟 。
5. 将含有洁净血浆的上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中。
6. 向上清液中加入 100 ng/ml 的 RNAse ，并在 37 °C 下孵育 10 分钟 ，以降解循环 RNA。
7. 将所有处理后的血浆转移至新的 2 ml 离心管中，并加入 0.5 倍体积的 1x PBS。
8. 涡旋混匀样品，使溶液充分混合。
9. 向样品中加入 0.05 倍体积的 Proteinase K 溶液（试剂盒中提供）。
10. 涡旋混匀样品，随后在 37 °C 下孵育 10 分钟。
11. 向样品中加入 0.2 倍体积的外泌体沉淀缓冲液，并通过倒置混匀溶液。
12. 将样品在 2 °C 至 8 °C 下孵育 30 分钟 ，然后在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟 。
13. 吸除并弃去上清液。沉淀物中含有分离得到的外泌体。
14. 加入选定的缓冲液以重悬外泌体沉淀。缓冲液的选择取决于后续分析计划，具体如下：
    1. 加入 100 µl 的 1x PBS，用于进行透射电子显微镜（TEM）分析。
    2. 加入 346.5 µl 专用于 RNA 提取的裂解缓冲液（来自商业试剂盒）（注意：存在化学危害）。
    3. 加入 100 µl 用于蛋白质提取的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.6 - 300 mM NaCl - 0.5% Triton X-100 - 1 mM PMSF - 10 µg/ml Leupeptin/Aprotinin），用于进行 Western Blotting 分析（注意：存在化学危害）。
15. 将重悬后的外泌体在 −20 °C 下保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
总外泌体分离试剂盒（从血浆中提取）	Invitrogen	4484450	使用蛋白酶K处理
核糖核酸酶A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
Illustra RNAspin 小量试剂盒 50	GE HealthCare	25-0500-71