三维DNA荧光原位杂交：一种在染色体上定位特定基因的技术

摘要

来源：Gallerani, G. 等. 利用医用导丝捕获循环肿瘤细胞的肿瘤细胞表征：基于免疫荧光与DNA FISH的三维方法. J. Vis. Exp. (2017).

从癌症患者血液中分离和表征循环肿瘤细胞（CTC）是一种非侵入性液体活检方法，与疾病复发和进展相关。本视频介绍了在医用导丝上捕获的CTC上进行DNA荧光原位杂交（DNA FISH）的技术，以研究特定目的基因。

方案

1. 3D DNA-FISH 第2天

注意：必须特别注意仪器和湿化室的高温。

1. 在开始DNA-FISH实验前约3小时，设置杂交炉和干热炉。将杂交炉温度设为75 °C，干热炉温度设为37 °C，并将0.4× SSC溶液（pH = 7.0 ± 0.1）冷却至4 °C。
   注意：FISH缓冲液的pH值至关重要，必须为7.0 ± 0.1。
2. 用预冷至冰浴温度的0.4× SSC溶液清洗金属丝3次。
   注意：在后续操作中需将金属丝避光保存，以防止荧光染料发生光漂白。
3. 在通风橱内避光干燥10分钟。
4. 涡旋振荡探针并离心5秒。
5. 取10 µL探针加入玻璃微量离心管中，用实验室封口膜覆盖管口。
6. 按如下方式离心微量离心管：将微量离心管用干燥吸水纸包裹后放入50 mL离心管中，短暂离心。
7. 小心将干燥后的金属丝放入微量离心管中，并插入金属丝塞。用橡胶胶水密封。
   注意：接下来的两个步骤涉及高温操作，请佩戴防护手套。
8. 将金属丝置于杂交炉内的避光湿盒中，75 °C孵育8分钟，以实现DNA完全变性。
9. 将湿盒转移至37 °C干热炉中过夜孵育。

2. 3D DNA-FISH 第3天

1. 将装有 0.4× SSC 溶液的载片染色缸放入水浴中，并将温度设定为 72 °C。
2. 检测 0.4× SSC 溶液的温度，直至达到 72 ± 1 °C。
3. 准备两个玻璃烧杯，一个装有 2× SSC + 0.05% Tween（pH = 7.0 ± 0.1）溶液，另一个装有蒸馏水。
4. 从干热烘箱中取出湿室，用镊子小心地从金属丝塞子上移除橡胶水泥，然后取出金属丝。
   注意： 小心地将金属丝未包被的一端穿过 IN-塞子，注意不要损坏功能化端。
5. 将金属丝浸入 72 °C 的 0.4× SSC 溶液中 2 分钟。
6. 在室温下用 2× SSC + 0.05% Tween 溶液清洗金属丝 30 秒。
7. 在室温下用蒸馏水清洗金属丝。
8. 在通风橱中避光干燥 10 分钟。
9. 在 2 mL 的 1× PBS 中配制 1.43 µM 的 DAPI 储存液。
10. 将金属丝的功能化端放入 2 mL 管中，与 DAPI 溶液在室温下避光孵育 1 小时。
11. 用 1× PBS 冲洗金属丝两次，并自然晾干。

3. 三维显微镜观察与分析

1. 将导线放入导线固定夹中。小心地将功能化尖端穿过专用固定夹的入口，直至尖端与耦合点对齐。注意不要损坏功能化尖端（图1a）。
2. 将专用固定夹放置在显微镜载物台上。使用20×物镜调节显微镜焦距。先粗略聚焦于专用支架，然后在DAPI通道中呈现亮色的细胞上进行精细调焦。

结果

图 1： 功能化导线、ALK断裂探针的示意图排列、ALK重排预期模式示意图以及专用固定装置。 （a）红色框标出导线的三个主要部分：功能化尖端、导线止位器和未功能化尖端。功能化尖端是导线最精细的部分，在操作过程中不得触碰，以避免细胞脱落或损伤。（b）绿色和红色探针分别结合于ALK基因位点上游和下游的序列（左侧）。右侧展示了典型的ALK排列模式示例。正常细胞中显示红色和绿色信号共定位；绿色与红色信号分离表明ALK基因染色体断裂（ALK基因易位），并出现一个绿色-橙色共定位信号（异常细胞-1）；一个红色信号和两个绿色信号提示一个红色信号丢失，提示存在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吐温-20 	BIO RAD	 # 1706531
Vysis 20X SSC (66g) 	Abbott Molecular Inc.	 # 30-804850	 按推荐方法用蒸馏水重悬成粉末
水	MilliPore
DAPI，FluoroPure 级	 Invitrogen	# D21490
ZEISS 荧光显微镜 Axioskop 	ZEISS