福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织保存：一种研究组织形态学的方法

摘要

来源：Nagaraj A.S.，等，建立与分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件。J. Vis. Exp. (2018)

以下视频介绍了如何通过甲醛固定和石蜡包埋来保存组织的形态结构。

方案

1. 组织切片的固定与处理

1. 将未培养的0 h对照样本或已培养的组织切片小心地转移至浸有PBS的滤纸上。
   1. 具体操作：在直径10 cm的培养皿中放置一张滤纸，并加入2–3 mL PBS使其浸透。将组织切片置于滤纸表面，使用镊子夹起滤纸并将其整体取出。
   2. 将带有组织切片的滤纸转移至组织包埋盒（histocassette）中，并在组织切片上滴加一滴稀释的苏木精染液（按1:1比例用去离子水稀释），以便在后续处理步骤中清晰标记组织切片的位置（图1D）。
   3. 盖上包埋盒盖子，将其放入4%中性缓冲福尔马林溶液中，在4 °C下固定过夜。
      注意：将组织切片放置于滤纸上时，需确保切片的上表面朝上；此方向对于后续切片与分析过程中识别切片的顶部、中部和底部区域至关重要，具体见步骤2.3所述。
2. 次日，将包埋盒转移至70%乙醇（EtOH）中，并立即开始进行石蜡包埋的组织处理步骤。
3. 在开始组织处理前，使用100%乙醇对组织包埋盒进行两次洗涤，每次10分钟。本实验采用微波组织处理仪进行处理。选择适用于1 mm组织厚度的程序，并遵循仪器手册中的操作说明（https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf）。
   注意：若使用其他类型的组织处理设备，应选择适用于薄组织样本的处理程序。
4. 进行石蜡包埋时，打开组织包埋盒，用解剖刀小心地将组织切片从滤纸上剥离。弃去滤纸，将组织切片转移至含有液态石蜡的包埋模具中。
   1. 用扁平重物等工具将组织轻轻压向包埋模具底部，以确保后续切片均匀。将包埋盒的底部置于模具上方，并在其上覆盖液态石蜡。将模具置于冷台上冷却30分钟，随后将模具与石蜡块分离。
      注意：除水平包埋外，也可选择垂直包埋，即将组织切片竖直放置。垂直切片可在单一切片上直接分析细胞活力或功能标志物表达的梯度变化。若采用水平包埋切片进行梯度分析，则需按照步骤2.2所述进行石蜡切片处理。

2. 甲醛固定及石蜡包埋（FFPE）组织的处理与分析

1. 使用切片机对FFPE组织切片包埋块制备4 µm的薄切片。切片时，调整包埋块的角度，使其表面相对于刀刃呈水平方向；这是确保在整个组织中获得厚度均匀切片的必要步骤。
2. 为便于捕获可能由培养引起的活力梯度、细胞在切片中的迁移，或培养后切片中生物标志物表达的梯度变化，应按照下文所述方法，从每个组织切片的顶部、中心和底部层次分别收集切片并置于载玻片上。
3. 首先将石蜡包埋组织切片的连续切片收集至载玻片的上部区域，随后继续将较深层组织的切片依次收集至载玻片的中部，最后收集至底部区域（图1E）。
   注意：为在一张载玻片上容纳三个切片，需修剪掉包埋组织周围多余的石蜡。
4. 将切片在37 °C下干燥过夜，随后按以下说明进行H&E染色或免疫组织化学分析。
   注意：若FFPE切片在高温或长时间储存条件下，可能发生抗原性丢失。建议将石蜡切片储存于4 °C，并在切片制备后6个月内完成免疫组织化学分析。
   1. 进行H&E染色时，按以下步骤对石蜡切片进行脱蜡和水化：二甲苯处理3次，每次5分钟；100%乙醇处理3次，每次1分钟；96%乙醇处理2次，每次1分钟；70%乙醇处理1次，1分钟；去离子水处理2次，每次1分钟。
   2. 将切片浸入新鲜过滤的苏木精溶液中染色10分钟，然后用流水冲洗5分钟。将切片浸入酸性酒精（1% HCl溶于70%乙醇）中2次，随后再次用流水冲洗5分钟，接着用0.5%伊红染色2分钟。
   3. 伊红染色后，按以下步骤通过酒精和二甲苯溶液对切片进行脱水：96%乙醇处理2次，每次15秒；100%乙醇处理3次，每次30秒；二甲苯处理3次，每次1分钟。最后，使用基于二甲苯的封片介质封固切片。

结果

图1：建立和分析小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤来源的组织切片外植体的工作流程示意图。（A）描述带瘤肺组织采集与切片前准备的示意图。从小鼠中取出肺叶，并将肿瘤组织从正常组织中解剖分离。黑色箭头和星号分别指示约4 mm和1 mm大小的肿瘤。白色箭头指示粘附在样品托表面的肺组织。红色箭头指向额外的一块正常肺支撑组织，用于保持肿瘤处于直立位置。（B）使用振动切片机进行切片并收集组织切片。白色箭头指示切片方向。将连续切片收集至含有冷的HBSS + P/S的24孔板中。这些切片可用于不同时间点（此处为24–72 h）的培养，以评估培养过程中肿瘤特异性标志物的表达（上排），或用于药物处理实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 组织培养板 	Sarstedt 	83.1802
PBS 	Lonza 	BE17-517Q
甲醛 	Fisher 	F/1501/PB08
三折组织包埋盒纸 	癌症诊断公司（Cancer Diagnostics） 	DX26280
组织包埋盒	 VWR 	720-2199
切片机 	Thermo Fischer Scientific 	HM355S
Leica VT1200 S 振动刀片切片机	Leica Biosystems	14048142066
用于 H&E 染色的苏木精	Merck	1.09249.0500
用于复染的苏木精	Dako	S3309
伊红	Sigma	E4382
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma	H6648