福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织保存:一种研究组织形态的方法

摘要

来源:Nagaraj A.S. 等人肿瘤切片外植体的建立和分析作为诊断测试的先决条件。J. Vis. Exp. （2018 年）

以下视频介绍了如何通过福尔马林固定和石蜡包埋来保留组织的形态。

方案

1. 组织切片的固定和处理

1. 小心地将未培养的 0 小时参比或培养的切片提起到浸泡在 PBS 中的滤纸上。
   1. 为此，在放置在 10 cm 板中的滤纸上添加 2-3 mL PBS。将切片放在滤纸上，用一对镊子将滤纸捞出。
   2. 将滤纸转移到组织盒中，并在组织切片顶部加入一滴稀释的苏木精（在去离子水中为 1:1），以在后续处理步骤中明显标记切片的位置（图 1D）。
   3. 关闭盒，将其转移到 4% 中性缓冲福尔马林溶液中。将组织在 4 °C 下固定过夜><。 注意:将切片放在滤纸顶部时，确保切片的顶部朝上;在切片和分析期间，这是遵循切片的顶部、中间和底部部分所必需的，如步骤 2.3 中所述。
2. 第二天，将包埋盒转移到 70% 乙醇中，并立即进行石蜡包埋组织处理步骤。
3. 在组织处理之前，用 100% 乙醇洗涤组织细胞 2 次，每次 10 分钟。在这种情况下，请使用微波站进行组织处理。选择用于 1 mm 组织厚度的程序，然后按照手册 （https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf） 中提供的说明进行作><。 注意:使用其他组织处理机时，请使用适用于薄组织样品的程序。
4. 对于石蜡包埋，打开组织膜盒并使用手术刀小心地从滤纸上提起切片。丢弃滤纸，将切片转移到含有液体石蜡的模具中。
   1. 将组织压在包埋模具的底部，例如用平重，以确保均匀切片。将组织盒的底部放在模具顶部，在其顶部添加液体石蜡。让模具在冷垫上冷却 30 分钟，然后将模具与石蜡块分离。
      注意:作为水平包埋的替代方法，可以通过将切片置于直立位置来垂直包埋肿瘤切片。垂直切片很容易分析单个切片上的活力梯度或功能标志物表达。水平嵌入切片的梯度分析需要石蜡切片，如步骤 2.2 中所述。

2. 福尔马林固定和石蜡包埋 （FFPE） 组织的处理和分析

1. 使用切片机制备 4 μm 的 FFPE 组织切片块薄切片。切片时，调整块的角度，使块的表面相对于刀片水平定向;这对于在整个组织中获得均匀的切片是必要的。
2. 为了能够捕获潜在的培养诱导的活力梯度、跨切片的细胞迁移或跨培养切片的生物标志物表达梯度，请从对象载玻片上每个组织切片的顶层、中心层和底层收集切片，如下所述。
3. 首先在载玻片的上部收集石蜡包埋的组织切片的连续组织切片。继续收集较深组织层的切片到中间，然后是载玻片的底部（图 1E）.
   注意:为了在载玻片上容纳三个切片，请修剪掉包埋的组织切片周围多余的石蜡。
4. 让切片在 37 °C 下干燥过夜，然后如下所述进行 H&E 染色或免疫组织化学。
   注意:当 FFPE 切片在高温下或长时间储存时，可能会发生抗原性丧失。石蜡切片建议在 4 °C 下储存，IHC 分析应在切片后 6 个月内进行。
   1. 对于 H&E 染色，按如下方式对石蜡切片进行脱蜡和再水化:二甲苯 3 次 5 分钟，100% 乙醇 3 次 1 分钟，96% 乙醇 2 次 1 分钟，70% 乙醇 1 x 1 分钟，和去离子水 2 次 1 分钟。
   2. 将切片在新鲜过滤的苏木精溶液中孵育 10 分钟，并在流动的自来水下洗涤 5 分钟。将切片浸入酸性酒精（1% HCl 在 70% 乙醇中）中 2 次，然后在流动的自来水下洗涤 5 分钟，然后与 0.5% 伊红孵育 2 分钟。
   3. 在伊红步骤之后，通过将载玻片浸入酒精和二甲苯溶液中来脱水切片，如下所示:96% 乙醇 2x 15 秒，100% 乙醇 3x 30 秒，二甲苯 3x 1 分钟。最后，将切片嵌入基于二甲苯的封固剂中。

结果

图 1:小鼠 NSCLC 肿瘤来源的切片外植体建立和分析工作流程的示意图。（A） 描述用于切片的荷瘤肺的收集和制备的示意图。从小鼠身上收获肺叶，并从正常组织中解剖出肿瘤组织。黑色箭头和星号分别表示大约 4 mm 和 1 mm 的肿瘤。白色箭头表示粘附在标本架表面的肺组织。红色箭头指向另一块正常的肺支持组织，以将肿瘤保持在直立位置。（B） 振动切片机切片和组织切片的收集。白色箭头表示切片方向。将连续切片收集到含有冷 HBSS + P/S 的 24 孔板中。切片可以培养不同的时间点（此处为 24-72 小时）以评估培养过程中的肿瘤特异性标志物表达（顶行），也可以用于进行药物治疗。C:载体对照，T:药物治疗（底行）。（C） 使用旋转孵育装置放置组织切片进行培养。倾斜 6 孔板，使一些培养基覆盖网格顶部，将组织切...

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