海洋微生物对微尺度营养层的趋化响应

摘要

本文描述了微流控通道的制备及其在实验中的应用，用于研究海洋微生物在斑块状营养环境中的趋化觅食行为，以及细菌在剪切流中的游动行为。

摘要

浮游微生物利用微尺度资源斑块的程度，将对海洋营养动力学和生物地球化学通量产生重要影响。然而，为了利用海洋中的营养斑块，运动型微生物必须克服分子扩散和湍流剪切等物理力的影响，这些物理力会限制斑块的可获得性以及细菌定位斑块的能力。直到最近，方法学上的局限性一直阻碍了对微生物在斑块状生境及真实小尺度流动条件下行为的直接观察。因此，目前我们关于海洋微生物行为的大部分知识主要来源于理论预测。为了获取有关海洋微生物觅食行为的新信息，我们应用软光刻微加工技术开发了两种微流控装置，用于构建（i）具有与海洋过程相关的尺寸和扩散特性的微尺度营养斑块，以及（ii）剪切速率与海洋中预期值相当的微尺度涡旋。这些微流控装置首次实现了对微生物在异质且动态的海洋微环境中游泳行为和趋化行为的直接观测。结合使用落射荧光显微镜和相差显微镜，可在观察微生物群体水平聚集反应以及个体微生物游泳行为的同时，直接测定营养斑块的物理尺寸和扩散特性。实验结果表明，某些种类的浮游植物、异养细菌和吞噬型原生生物能够在极短时间内有效定位并利用扩散中的微尺度资源斑块。我们还发现，在中等剪切速率范围内，海洋细菌能够抵抗流体流动，自主地在其环境中游动；但当剪切强度超过某一阈值时，细菌会被迫沿剪切流方向排列，其自主游泳能力显著下降，难以摆脱流场干扰。微流控技术为研究水生微生物生态学提供了一种新颖且低成本的方法，因其能够在微尺度上精确模拟真实的流场和底物浓度梯度，特别适用于在最小相互作用尺度上对微生物行为进行研究。因此，我们认为微流控技术是深入理解海洋微生物生态的重要工具。

方案

准备

1. 创建一个掩膜 

使用 CAD 软件设计用于在透明胶片上进行高分辨率打印的通道。这将作为“掩模”。

在洁净室中：

2. 清洁并烘烤晶圆

首先用丙酮冲洗晶圆，然后迅速用甲醇冲洗，接着用异丙醇冲洗。最后用氮气吹干晶圆。

将晶圆放入烤箱中（130°C）烘烤5分钟。

3. 涂覆晶圆

将晶圆置于旋涂机的中心位置。从试剂瓶中将光刻胶（SU-8）滴加到晶圆表面。让 SU-8 自然流动并松弛约 10 秒。启动旋涂仪，用 5 秒时间将转速从 0 加速至 500 转/分钟；保持 500 转/分钟 10 秒；再用 10 秒时间加速至最终转速，并在最终转速下维持 30 秒。最终转速取决于目标涂层厚度及所使用的 SU-8 型号。详细参数可参考 http://www.microchem.com/

4. 软烘

涂覆晶圆后，先在65°C下烘烤，然后在95°C下烘烤。烘烤时间根据目标厚度和所用光刻胶类型而定。随后，让晶圆在室温下静置至少5分钟。

5. 暴露

将掩模置于晶圆顶部，并根据SU-8手册中推荐的时间用紫外光照射晶圆。

6. 曝光后烘烤

按照SU-8说明书的指示，先将晶圆在65°C下烘烤，然后在95°C下烘烤。

7. 显影晶圆以获得“母版”（模具）

准备一个盛有显影剂（PMMA）的烧杯。将晶圆浸入烧杯中，同时非常轻柔地晃动烧杯，直至光刻胶未曝光部分被完全洗去。

在我们的实验室中：

8. 准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）并将其倒入晶圆上

将PDMS与其固化剂按10:1的比例混合到杯中。充分搅拌使其均匀混合：此过程会产生大量气泡，使混合物呈现不透明状。将混合物倒在“母模”上。

9. 在真空室中去除气泡

为去除气泡，将覆盖有母模和PDMS混合物的样品放入真空室，直至所有气泡完全消失。

10. 烘箱烘烤

           在65°C的烘箱中至少烘烤12小时，以固化PDMS。

11. 打孔

将PDMS从模具上剥离，并为通道的入口和出口打孔。

在洁净室中（未显示）

12. 等离子体键合

将PDMS层和玻璃载玻片均用氧气等离子体处理1分钟后，通道即与玻璃载玻片键合。

实验：

实验 #1：研究海洋微生物对微尺度营养层的趋化反应

1）设置实验

1. 将生物体和底物加入玻璃注射器中
2. 将微流控通道放置在显微镜载物台上，并将管路连接至相应的入口和出口
3. 将管路连接至废液储液池。确保管路完全浸没在废液储液池的液体中，以避免压力波动
4. 将注射器安装到注射泵上，并连接至阀门和管路
5. 设置显微镜：光照条件、放大倍数等
6. 聚焦到通道中的合适位置
7. 使用装有人工海水的大注射器去除通道中的气泡
8. 在注射泵上设定适当的流速。本实验中为 2 ml/min，对应通道内平均流速为 220 µm s^-1

2）进行实验

1. 启动注射泵，以在通道内建立营养梯度
2. 当流动稳定且营养带形成后，停止注射泵的流动，并从此时刻开始记录时间
3. 营养带开始在横向扩散
4. 以固定时间间隔使用图像分析软件记录一系列帧，生成“视频”
5. 通过计算两个连续帧之间的时间差图像  ，区分游动的生物体，使得 仅运动的物体被可视化，从而能够将运动细胞与静止颗粒及 背景噪声区分开来
6. 拍摄视频，以相对于营养斑块的位置确定通道内细胞的位置
7. 以固定时间间隔录制10-20分钟的视频，用于分析生物体的位置和游动模式
8. 通过使用图像分析软件将不同帧中生物体的位置叠加（为每个像素分配在视频持续时间内该像素记录到的最大光强度），我们可以 获得游动细胞的轨迹信息 

实验 #2：研究涡流中剪切力对海洋细菌游动的影响

1. 通过使用不同的通道几何结构，我们可以观察细菌在不同剪切速率的涡流中游动的行为

讨论

深入了解海洋微生物如何与其局部的化学和物理环境相互作用，对于更全面、更精确地认识浮游微生物在海洋营养循环和碳循环中的作用至关重要（Azam 和 Malfatti，2007）。然而，由于许多重要的微生物相互作用发生在极小的尺度上（< 毫米级），技术上的限制一直阻碍了对海洋中游动微生物所经历的复杂生物-物理-化学异质环境中微生物行为的细致研究。近年来微流控技术的进步（Whitesides 等，2001）使得能够在复杂的微生境中对微生物生态进行详细分析（Mao 等，2003；Park 等，2003；Keymer 等，2006；Marcos 和 Stocker，2006）。本文所描述的微流控装置使我们能够在单细胞水平上研究海洋微生物对扩散性营养斑块的趋化响应（Blackburn 等，1997，1998），以及微生物在湍流剪切环境中的游动行为。

用于制造微流控通道的软光刻 fabrication 工艺可在通道结构内实现复杂的细节，从而精确控制通道内的流体流动和浓度梯度。该 fabrication 技术提供的灵活性使得能够制备不同尺寸的通道，用于开展对比研究。此处应用的图像分析系统...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS，Sylgard 184	硅弹性体试剂盒	Dow Corning		http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100	光刻胶	MicroChem Corp.		www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E 倒置显微镜	显微镜	Nikon Instruments
PEEK 管（内径 0.762 mm，外径 1.59 mm）	工具	Upchurch Scientific		www.upchurch.com
注射器（鲁尔锁扣式针头）	工具	BD Biosciences
接头部件 P-704-01	工具	Upchurch Scientific		用于将管路连接至鲁尔锁扣式注射器
注射泵（PHD 2000 可编程型）	设备	Harvard Apparatus
CCD 相机（PCO 1600）	设备	Cook