体外胰腺神经可塑性检测：研究胃肠道神经元在暴露于健康与癌变人胰腺组织提取物后的变化

摘要

来源：Demir, I. E., 等. 模拟胰腺神经可塑性：体外双神经元可塑性检测. J. Vis. Exp. (2014).

本视频演示 体外 用于研究背根神经节和肠肌神经丛神经元在暴露于健康与癌变人胰腺组织提取物后形态学变化的神经可塑性检测方法。该检测方法可使我们研究神经突的生长、分支模式及神经元大小。

方案

1. 神经元的分离

提取/上清液收集完成后，继续进行神经元的分离。

1. 对于背根神经节（DRG）神经元，取出生后第2至12天（P2–P12）新生大鼠，在断头后通过体视显微镜解剖分离颈段至腰段的背根神经节 （图1A）为了获得足够用于24孔板的背根神经节（DRG）神经元，每块板需收集一只新生大鼠从颈段至腰段的所有背根神经节（共52个DRG）。
2. 用显微剪刀切除背根神经节的外周（神经）突起和中枢突起（根部）。若保留这些突起，将妨碍吹打分散组织的操作，并增加成纤维细胞污染培养物的风险。
3. 对于肌间神经元，从小肠上切除肠系膜，并手动小心剥离小肠的浆膜肌层（有关肌间神经丛分离的详细方案， 图1B对于MP，每24孔板收集两只大鼠的神经丛。
   注意： 尽量轻柔操作，以避免浆膜肌层撕裂，因为撕裂会阻碍其与小肠的成功分离。
4. 将背根神经节和血清肌层收集于含庆大霉素（500 ml 培养基中含 20 mg）和甲硝唑（500 ml 培养基中含 2.5 mg）的冰冻最低必需培养基（MEM）中。
5. 采集背根神经节（DRG）后，将其置于含有II型胶原酶的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中孵育20–30分钟。对于巨噬细胞（MP）的分离，根据动物年龄，使用II型胶原酶孵育1–3小时。 （图 1C）.
6. 对于微脉管（MP），在体视显微镜下收集网状的MP片段，并转移至冰冻的MEM中。
7. 然后使用直径递减的注射器对背根神经节（DRG）和髓核组织（MP）进行研磨处理。
   注意： 过度吹打会破坏神经元，但对胶质细胞的损伤较小。
8. 一旦含有DRG或MP的培养基变得浑浊，于93.9 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于Neurobasal培养基中（添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和2% B-27）。
9. 统计细胞总数（即 神经元和胶质细胞）通过血细胞计数板进行计数。
   注意： 所需细胞数量取决于测量参数。在进行神经突密度定量时，需要比测量神经突生长、胞体大小以及单个神经元分支模式时更密集的培养，因此需要更多的细胞。对于神经突密度的测量，请使用 例如 每孔10,000个细胞（神经元+胶质细胞）或每孔1,500个神经元。若需对单个神经元进行形态学测量，建议进行短暂（1分钟）的胰蛋白酶消化，并以每孔2,500个细胞或每孔400个神经元的密度接种。通常每只大鼠获得的细胞数约为300,000–500,000个。
10. 将细胞接种于前一晚已包被的13 mm盖玻片上，并用Neurobasal培养基（添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和2% B-27）补满孔内。 （图 1D）.
    注意： 使用多聚-D-赖氨酸（40 mg/m²) 或鸟氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片（每种各1 mg/ml）。细胞在聚-D-赖氨酸上贴附极快，因此适用于需要大量细胞的实验即 神经突密度测量）。与层粘连蛋白的黏附性总体较弱，但层粘连蛋白能显著促进神经突生长。因此，在进行神经元分支和神经突长度测量时，优先选用鸟氨酸/层粘连蛋白包被。
11. 过夜培养使细胞贴壁。次日，制备添加提取物的培养基（提取物/上清液终浓度为 100 µg/ml）。
12. 吸弃接种培养基，可选地用 PBS 轻柔洗涤一次，然后缓慢加入含提取物/上清液的培养基 （图1E）.
13. 培养细胞 48 小时。吸去培养基，用 4% 多聚甲醛固定，用于免疫染色。 （图1F）.
14. 使用神经元特异性抗体进行双重免疫荧光染色例如 β III-微管蛋白）和胶质细胞特异性（例如 胶质纤维酸性蛋白/GFAP 标记物 （图1G）.
15. 用于形态测量时，使用配备有CCD相机的倒置显微镜，并结合自动化软件，以实现神经突密度的测量（参见 表格).
16. 通过在每张盖玻片上神经生长最密集的4个不同区域各选取4-5张具有代表性的200倍显微照片，叠加50 µm × 50 µm网格，计数交叉纤维的数量，以测定神经元培养物的神经突密度。从每张盖玻片中随机选取30个孤立神经元，标记其神经突和胞体，可测量神经突生长、每个神经元的平均分支数、平均分支长度及胞体大小。 （图1H）.

结果

图 1. 体外 神经可塑性检测的示意图。 本实验利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肠肌间神经丛（MP）神经元，研究胰腺组织提取物或细胞上清液对神经元和胶质细胞形态的影响。通过前路椎板切除术获取 DRG，通过小肠切除及机械剥离获取含 MP 的浆膜肌层（A，B）。经 II 型胶原酶消化后，将神经元以所需密度接种（详见正文）并培养 24 小时（C，D）。随后，在神经元生长培养基中加入 freshly prepared 胰腺（或任何感兴趣胃肠道器官）提取物及细胞上清液，浓度为先前确定的浓度（E）。48 小时后，用 4% 多聚甲醛固定培养物，并对神经元和胶质细胞标志物进行双重免疫染色（F，G）。通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P1149
鸟氨酸/层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm 盖玻片	Merck		用于24孔板
Dismembranator S 组织分散器	Sartorius
抗 Beta-III 微管蛋白抗体	Millipore	MAB1637	使用浓度 1:200
抗 GFAP 抗体	DAKO	M0761	使用浓度 1:400
RIPA 裂解缓冲液 + 蛋白酶抑制剂			任意供应商
Neurobasal 培养基	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 添加剂	Gibco/Life Sciences	17504044	B-27 的质量已知依赖于批号
庆大霉素/甲硝唑			任意供应商
最低必需培养基	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	当含有 Ca/Mg 时可增强胶原酶活性
II 型胶原酶	Worthington Biochemical	CLS-2	应选用酶活性至少为 200 U/mg 的批次
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco/Life Sciences	25200056
4% 多聚甲醛			任意供应商
AnalySIS docu 软件	Olympus