结直肠癌细胞中的磷酸酶活性检测：一种检测结直肠癌细胞中Tau蛋白磷酸化状态的方法

摘要

来源：Huda, M. N.，等。 结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法。J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了一种通过磷酸酶活性检测来评估结直肠癌细胞中tau蛋白磷酸化状态的实验方案。磷酸酶可作用于tau蛋白上的磷酸基团，使tau蛋白在SDS-PAGE凝胶中的迁移率较未经处理的tau蛋白样品提高。

方案

1. 磷酸酶实验

1. 当细胞达到约65%融合度时（通过显微镜观察估算），处理细胞裂解物，移除补充培养基的MEM培养基，加入含5 µM、10 µM和30 µM姜黄素或25 mM、50 mM和100 mM LiCl的无血清MEM培养基。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育24小时。处理24小时后，用1 mL冰浴磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并使用细胞刮刀刮取细胞。将刮下的细胞转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以1,800 x g 离心4分钟，获得细胞沉淀。在4 °C下将沉淀重悬于100 µL完全RIPA裂解缓冲液中，持续20分钟，并定期轻弹管壁以裂解细胞。对样品进行短暂超声处理。将细胞匀浆在台式离心机中于4 °C下以22,570 x g 离心20分钟。用移液器将上清液转移至其他标记好的离心管中，用于碱性磷酸酶在碱性磷酸酶缓冲液中的反应。
   1. 对于对照组和处理组样品，均准备含有20 µg总蛋白的20 µL样品。加入含有20 µg总蛋白体积的细胞裂解物，随后加入2 µL碱性磷酸酶缓冲液和10 µL碱性磷酸酶。用蒸馏水补足至20 µL。
2. 在37 °C下孵育样品1小时。通过加入乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度50 mM，或加入正钒酸钠（Na₃VO₄）至终浓度10 mM终止反应。也可通过在75 °C加热5分钟终止反应。
3. 在样品与磷酸酶孵育完成前，准备相同浓度但未添加磷酸酶的样品，以便与磷酸酶处理的样品进行比较。
4. 加入新配制的含400 mM DTT的4X SDS上样缓冲液。
5. 将样品在金属浴中于100 °C孵育5分钟。使用涡旋振荡器混匀样品。室温冷却约10–15分钟。
6. 组装电泳系统，用于进行10%聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE电泳。
   1. 在10%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入10 µg蛋白（13 µL样品）。同时加入分子量标准蛋白Marker。
   2. 加样后，将电泳系统的正负极连接至电源，维持恒定电压。初始以70 V运行20分钟，使蛋白样品从浓缩胶进入分离胶。随后将电压升至125 V，继续电泳约70–120分钟，直至样品和蛋白Marker到达凝胶底部。
   3. 电泳结束后，使用湿转法电转印系统将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。在100 V下转移约100分钟。
   4. 通过在分子量Marker一侧做一小切口标记印迹膜。使用透明塑料片和锋利刀片进行切割。
7. 用4% BSA封闭缓冲液在室温下封闭膜90分钟。
8. 将膜在一抗溶液（抗tau抗体，1:5,000稀释）中于4 °C孵育过夜。随后用PBST洗涤四次，每次7分钟。
9. 配制相应的二抗溶液（山羊抗小鼠IgG，1:5,000稀释），在室温下孵育膜90分钟。用PBST洗涤四次，每次7分钟。
10. 根据化学发光试剂盒说明书进行显影。用透明塑料膜包裹印迹膜，使用化学发光成像系统及配套软件采集图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HCT 116 细胞	ATCC	CCL-247
100 mm 培养皿	Corning	430161
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
胎牛血清 (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	储存于 -20 °C
Anti-Tau 13 抗体	Abcam	ab19030
二硫苏糖醇 (DTT)	Roche	10 708 984 001	储存温度 2–8 °C
姜黄素	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	储存温度 2–8 °C
Anti-Tau (磷酸化 S396) 抗体	abcam	ab109390
FastAP 热敏感碱性磷酸酶	Thermo Scientific	EF0651	储存于 -20 °C
PMSF	Sigma	P7626	室温储存
磷酸酶抑制剂混合液	Cell Signalling	5870	储存于 4 °C
蛋白酶抑制剂混合液	Cell Signalling	5871	储存于 4 °C
山羊抗小鼠 IgG 二抗	ThermoFisher	A-11005	避光储存于 4 °C
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Affymetrix	75819
分子成像仪	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	储存于 4 °C
RIPA 缓冲液	Sigma	R 0278	储存温度 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	约 25 °C 下储存
PVDF 膜	Bio-Rad	162-0177
山羊抗小鼠 IgG 二抗	ThermoFisher	A-11005	避光储存于 4 °C
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Affymetrix	75819
蛋白测定染料试剂	Bio-Rad	500-0006
超声破碎仪	Fisher Scientific	Model 500
微量离心机	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R