使用随机DNA文库进行无引物适配体筛选

摘要

SELEX 流程包含多轮筛选，每轮筛选都需要再生结合的配体，而配体再生又需要随机文库区域两侧带有固定的引物序列。这些固定的引物序列可能会干扰筛选过程（导致假阳性或假阴性）。本文介绍了一种无需引物的实验方案。

摘要

适配体是一类具有高度结构化的寡核苷酸（DNA 或 RNA），其与靶标的结合亲和力可与抗体相媲美¹。它们通过一种名为指数富集配体系统进化（SELEX）的体外筛选过程被鉴定出来，能够识别多种多样的靶标，从小分子到蛋白质及其他大分子均包括在内^2-4。适配体具有一系列适合体内诊断和/或治疗应用的特性：除了具有良好的特异性和亲和力外，它们易于合成，能耐受更严苛的处理条件，免疫原性低，且因其相对较小的分子尺寸，可更容易地穿透组织。

通过标准SELEX流程筛选出的适配体通常包含约80个核苷酸（nt），因为它们通常来源于具有约40 nt长随机区域的核酸文库，两侧各带有约20 nt的固定引物序列。因此，这些固定引物序列可能占文库序列的近50%，在筛选过程中可能对适配体的识别产生正面或负面的干扰³，尽管生物信息学分析表明，固定序列在筛选完成后对适配体结构的贡献并不显著⁵。为解决这些潜在问题，研究人员已在SELEX循环过程中使用互补寡核苷酸阻断引物序列，或将引物序列中途更换为其他序列⁶，或将其截短至6–9 nt^7,8。Wen和Gray⁹设计了一种无引物的基因组SELEX方法，在筛选前完全去除文库中的引物序列，随后再重新生成引物以实现对筛选出的基因组片段的扩增。然而，该技术需要构建一个独特的基因组文库，其多样性有限，且在多轮筛选后的再生依赖于线性再扩增步骤。另一种方法是利用高效分离技术来规避固定引物序列带来的问题，但该方法在PCR扩增方面仍面临挑战¹⁰。

我们开发了一种无引物（PF）筛选方法，该方法显著简化了SELEX流程，并有效消除了引物干扰问题^{11, 12}。该实验方案操作简便：首先将文库的中心随机区域在去除无关侧翼序列后进行纯化，然后使其与合适的靶标结合（例如纯化的蛋白质或细胞系等复杂混合物）；接着回收结合的序列，重新连接侧翼序列并进行扩增，以生成被筛选的亚文库。作为示例，本文中我们针对黑色素瘤的蛋白标志物S100B筛选了适配体。经过几轮筛选后的结合实验显示，其解离常数（Kd）达到10^-7 - 10^-8 M范围，并且我们证明这些适配体在夹心结合模式中具有良好的功能效果。

方案

1. 无引物筛选方案的简要描述

使用相应的寡核苷酸通过PCR构建了双链DNA文库（图1和图2，步骤a），该寡核苷酸包含一个由30个核苷酸组成的中央随机区域，两侧为两个引物结合区。开发了两种略有不同的“无引物”（PF）方案。在该双链DNA文库中，5'区域包含一个内切酶Nt.BstNBI的“切刻”位点；该酶可识别双链DNA，但仅切割DNA底物的一条链。双链DNA文库的3'区域包含另一个“切刻”位点，用于内切酶Nt.BbvCI，该酶同样识别双链DNA并仅切割一条链，在3'端留下CC序列（PF₁）；此外还包含一个BspMI内切酶限制性酶切位点，该位点可切割双链，不额外留下3'核苷酸（PF₂）。我们通常首先采用PF₁方案（因其在筛选过程中更易于分离产生的片段；见下文），随后在后续筛选轮次中采用PF₂方案。

通过Nt.BbvCI/Nt.BstNBI或BspMI/Nt.BstNBI对双链DNA文库进行酶切，并经凝胶纯化后，分别获得32个核苷酸长度的5'-pN30-CC-3'片段（记为32+-片段）和30个核苷酸长度的5'-pN30-3'片段（记为30+-片段）。32+-片段包含30个核苷酸的随机区域，并在3'端带有一段CC侧翼序列（PF₁）。30+-片段（PF₂）仅包含30个核苷酸的随机区域序列。“自桥接”66--片段（包含带有5'和3'侧翼序列的随机N30区域）通过凝胶纯化获得（Nt.BbvCI或Nt.BstNBI仅切割上层“+”链）。该自桥接片段可直接在PF₁方案中获得，或在PF₂方案中通过仅使用Nt.BbvCI或Nt.BstNBI切割文库DNA后生成并分离得到（图1和图2，步骤b）。将32+-片段或30+-片段与纯化的蛋白质或培养的黑色素瘤细胞共同孵育，使片段与蛋白质或细胞结合，随后洗去未结合的片段（图1和图2，步骤c）。将结合或筛选出的片段用于重新生成引物区域。

在杂交/连接反应中，自桥接结构与32+和30+片段的纯化同时进行；5'端引物与文库构建所用引物相同，3'端引物则替换为含有Sp6转录启动子的匹配引物（图1和图2，步骤d）。杂交/连接反应产物随后用于 体外 RNA转录（图1和图2，步骤e）。RNA转录完成后，使用DNase I消化连接的DNA（包括未被选择的自环化DNA片段），以去除干扰性背景序列。逆转录（RT）-PCR结果表明，引物再生产物可被高效再扩增，完成一轮筛选（图1和图2，步骤f）。在无逆转录对照PCR中，高循环数下出现的背景扩增信号可通过额外的DNase I消化完全去除，在常规采用的较低循环数下则无法检出。

经过7轮筛选后，对适配体的结合特性进行了表征。其解离常数（Kd）均在10^-7至10^-8 M范围内（图3）。在结合实验中，多种适配体组合表现出叠加结合效应，表明它们靶向S100B蛋白上的不同位点。因此，我们采用“三明治”式结合实验检测了适配体对的性能，实验体系包括：在玻璃微阵列（Codelink芯片）上使用荧光标记的第二适配体，以及在修饰的金纳米线上将第二适配体偶联至50 nm金纳米颗粒（AuNPs；图3）。在这两种情况下，结合特异性均很高：在Codelink微阵列上，对于在Kd测定中未显示叠加结合的适配体，未观察到三明治式结合信号；在修饰的纳米线上，几乎未观察到对非靶标蛋白的结合，且可通过适配体偶联的AuNPs直接观察单个三明治复合物（图3）。

2. 材料

2.1. PF DNA 文库的构建及结合片段的再扩增

详细步骤见 Pan 和 Clawson，2009 年；Pan et al.，2008 年。

2.2. 基于纯化蛋白的筛选

1. 20 mM Tris-HCl，pH 7.4
2. 32+-片段和30+-片段
3. 筛选缓冲液（含2.5 mM CaCl₂、5 mM MgCl₂的1X磷酸盐缓冲液，pH 7.4，Gibco）
4. Ni-NTA 琼脂糖珠（Qiagen）
5. 聚丙烯柱（Qiagen）
6. 结合缓冲液（50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.2，150 mM NaCl）
7. 在结合缓冲液中表达并纯化的S100B蛋白（5 μg/μL）
8. 苯酚:氯仿:异戊醇（pH 7.9，Ambion）
9. 3 M NaAc，pH 5.2
10. 100% 和 70% 乙醇

2.3. 所选双链DNA文库的TOPO克隆与测序分析

1. 7^th 对选定的PCR产物进行扩增（可进行额外轮次以继续优化适配体结合）
2. pCR2.1-TOPO 载体（Invitrogen）
3. DH5感受态细胞（Invitrogen）
4. 质粒小提试剂盒（Qiagen）
5. M13 正向引物
6. Informax 的 Vector NTI（Invitrogen）

2.4. 适配体的结合特性

1. 适配体与对照寡核苷酸（N₃₀CC 和 N₃₀，IDT）
2. T4 多核苷酸激酶（New England Biolabs）
3. γ-³²P-ATP（3000 Ci/mmol；10 μCi/ml）
4. 结合缓冲液中的纯化 S100B 蛋白（5 μg/μL）

2.5. 使用纯化的 S100B 蛋白与筛选出的适配体进行夹心结合实验

1. 1^st 适配体偶联至 a.) Codelink 微阵列载片 或 b.) Au 纳米线。
2. 纯化的 S100B 蛋白，稀释至 0.125 μ70 分钟 μl 对于 a) 或 1 μ50 分钟 μl 对于 b)。
3. 2^nd 适配体标记方式如下：a.) 使用Alexafluor 546标记，用于Codelink芯片载片；或 b.) 与50 nm AuNPs偶联，用于修饰金纳米线的研究。

3. 方法

3.1. PF DNA 文库的构建

适配体筛选的详细方法与实验方案可参见 Pan 和 Clawson，2009；Pan et al.，2008。

3.2. 使用纯化的 S100B 蛋白进行适配体筛选

以人S100钙结合蛋白B（S100B，基因编号#6285）为靶标。使用QIAexpressionist系统（QIAGEN）表达并纯化带有His₆标签的S100B蛋白（长度为98个氨基酸）。如需要或有指示，可通过酶切方法去除His₆标签。在筛选轮次中，每步操作均保留1 μL样品用于液体闪烁计数，以测定总体结合效率。

3.2.1. PF文库-DNA片段的制备

1. 将32⁺和30⁺片段重新悬浮于40 μL的20 mM Tris-HCl（pH 7.4）中。
2. 在85°C加热3分钟，然后在37°C孵育箱中冷却至37°C，持续3分钟。
3. 加入760 μL筛选缓冲液（含2.5 mM CaCl₂、5 mM MgCl₂的1×磷酸盐缓冲液，pH 7.4，GIBCO），在37°C孵育3分钟，随后在室温（RT）放置10分钟。
4. 通过预先用筛选缓冲液洗涤过的Ni-NTA琼脂糖珠层析柱（QIAGEN），之后于室温保存待用。

3.2.2. 在室温下制备 Ni-NTA 琼脂糖珠结合的 S100B

1. 将400 μL Ni-NTA琼脂糖珠离心3秒，弃去上清液。
2. 加入400 μL结合缓冲液（50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.2，150 mM NaCl），轻轻吹打5次进行洗涤，然后离心并弃去上清液。
3. 重复步骤2两次。
4. 加入400 μL纯化的S100B蛋白（5 μg/μL，溶于结合缓冲液中），每3分钟轻轻吹打5次，共孵育15分钟。
5. 离心并弃去上清液。
6. 加入400 μL结合缓冲液，轻轻吹打3次以洗涤珠上结合的S100B，然后离心并弃去上清液。
7. 重复步骤6两次。

3.2.3. S100B结合适配体的筛选

1. 将32+和30+片段从3.2.1转移至珠粒结合的S100B上。
2. 孵育15分钟，每隔3分钟轻轻吹打混匀一次。
3. 用800 μL结合缓冲液轻轻吹打洗涤S100B-DNA复合物，然后离心并弃去上清液。
4. 重复步骤3两次。

3.2.4. S100B 筛选适配体的回收

1. 加入 200 μL 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，在 85°C 下加热 3 分钟，涡旋振荡 1 分钟后离心，然后将上清液转移至新管中。
2. 重复步骤 1 一次，并合并上清液。
3. 按照先前发表文献（11, 12）中的步骤 9–12 纯化所选的 DNA 片段。

3.2.5. 用于鉴定共有序列适配体的TOPO克隆与测序分析

1. 克隆10^th 将选定的PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen公司产品）。随着进一步筛选的进行，可进行额外的克隆操作。
2. 使用M13正向引物对40-50个单菌落进行测序（我们使用赫尔希医学中心分子遗传学核心实验室）。
3. 使用 Invitrogen 公司的 Informax Vector NTI 对选定序列进行比对。
4. 根据比对结果确定共识序列。
5. 随后，从 Integrated DNA Technologies 公司购买了共识适配体。

3.3. 使用选定适配体对的夹心结合测定

3.3.1. 使用荧光标记的2进行微阵列分析^nd 适配体

1. 将带有5'-胺基己基（amineC6）修饰的共识第一代适配体（Consensus 1^st Aptamers）合成后，用打印缓冲液配制成终浓度为15 μM的溶液，并在宾夕法尼亚州立大学大学公园分校（PSU, University Park）DNA微阵列实验中心，使用Apogent Discoveries MicroGrid阵列仪按照Codelink推荐的操作流程，点样至Codelink活化载玻片（GE Healthcare/Amersham Biosciences）上。每张载玻片上打印12个阵列。
2. 杂交反应在2×8格式的微阵列杂交盒（Microarray Hybridization Cassette，Array It, TeleChem International）中进行。使用无核酸酶粘性密封膜（AlumaSeal II, Research Products International）将杂交盒密封，以防止蒸发。
3. S100B蛋白用PBS缓冲液稀释至适当浓度，取70 μl加入杂交盒的各个孔中，在室温下与Codelink载玻片上固定的适配体结合1小时。随后，各孔分别用含5 mM MgCl₂的PBS缓冲液（PBSM）洗涤3次，吸除多余的洗涤液。将荧光标记的适配体用PBSM缓冲液稀释至0.125 μM（终体积70 μl），先于85 °C加热3分钟，再置于冰上3分钟。将处理后的适配体加入杂交盒各孔中，室温孵育1小时。再次对各孔分别用PBSM洗涤3次。随后拆开杂交盒，将整张载玻片用PBSM冲洗，然后通过离心彻底干燥，并使用Packard Biosciences ScanArray 4000XL扫描仪（Perkin Elmer）进行扫描。

3.3.2. 使用2的衍生化纳米线格式^nd 与50 nm AuNPs偶联的适配体

通过在多孔氧化铝膜内进行恒电流电沉积，按照先前发表的方案（13, 14）合成了金纳米线（长度约 5 μm，直径 320 nm）。在多孔膜溶解后，将纳米线重新悬浮于 1 mL 乙醇中。

如前所述，DNA购自Integrated DNA Technologies。金纳米颗粒（50 nm）购自Ted Pella。巯基化DNA在100 mM DTT和0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 8.3）中孵育1小时进行切割，随后通过Centri-spin 10柱进行纯化。

适配体与金纳米线和纳米颗粒的连接

取50 μL金纳米线加入0.5 mL防粘离心管中，用10 mM磷酸缓冲液（含300 mM NaCl，pH 7.4）洗涤。将5'端硫醇化修饰的DNA（5'端带有10个T的间隔序列）以终浓度0.4 μM加入纳米线溶液中。样品涡旋振荡30分钟，随后用10 mM磷酸缓冲液（含300 mM NaCl，pH 7.4）离心洗涤三次（8100 g），再用50 mM磷酸缓冲液（含5 mM MgCl₂，pH 7.2）洗涤三次。将DNA包被的纳米线重悬于100 μL缓冲液中，实现两倍稀释。

DNA 修饰的 AuNPs 通过加入 50 制备 μl 100 mM 2^nd 适配体（5'端带有10个T的间隔序列）加入1 mL 50 nm AuNPs中，37℃加热°C 下加热一小时。加热后，加入 10 mM 磷酸钠缓冲液、1 M NaCl，pH 7.4（25 μL 两次，随后 100 μL, 150 μL 和 128 μL）间隔0.5小时。将偶联物置于37°C 将加热块在使用前过夜预热。样品用 50 mM 磷酸盐缓冲液、5 mM MgCl 洗涤 3 次₂，pH 7.2。将偶联物重悬于120 μL缓冲液。

纳米线上的三明治杂交

将1 μL稀释后的DNA包被的金属丝加入PCR管的缓冲液中。加入S100B蛋白或HtrA1对照蛋白（1 μg/μL），使缓冲液中蛋白终浓度为1 μM，总体积为50 μL（约每平方纳米金纳米线表面添加10–12个蛋白分子）。样品涡旋混合约2小时。通过离心（8100 g）用50 mM磷酸盐缓冲液（含5 mM MgCl₂，pH 7.2）洗涤金属丝三次，每次将金属丝重悬于20 μL AuNP/DNA偶联物中。金属丝在偶联物中涡旋混合2小时，然后用50 mM磷酸盐缓冲液（含5 mM MgCl₂，pH 7.2）经离心（1300 g）洗涤5次，以去除多余的纳米颗粒。将样品重悬于20 μL缓冲液中，随后滴加至金膜包被的硅晶圆表面，干燥后用于场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）分析。

采用配备肖特基场发射电子源、工作电压为5.00 kV的Leo 1530场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）获取纳米线的显微图像。

4. 代表性结果

图1. 5'-无引物（PF₁）和完全无引物（PF₂）实验方案。

(A) PF₁ DNA-适配体筛选流程。将文库寡核苷酸退火后进行PCR扩增，获得双链DNA文库（a）。通过Nt.BstNBI/Nt.BbvCI酶切（切割位点以红色箭头标出）和凝胶纯化，从PF单链DNA文库中制备5'-端无引物（PF₁）的随机区，并通过凝胶纯化分离自桥结构（黑色箭头）（b）。经过筛选后（c），将筛选得到的序列（命名为pS30-CC）与其对应的寡核苷酸以及自桥结构杂交，并连接以重新生成先前被去除的引物区域。在此阶段，引入在3'-端含有Sp6启动子的引物（d）。随后以此为模板转录出包含筛选序列的RNA（e）。最后，通过RT-PCR特异性再扩增RNA（模板DNA被消化），获得的筛选子文库即可用于下一轮筛选（f）。

(B) PF₂ DNA-适配体筛选流程。将文库寡核苷酸退火后进行PCR扩增，以获得双链DNA文库（a）。通过Nt.BstNBI/BspMI酶切（切割位点以箭头表示）并经凝胶纯化，从PF单链DNA文库中制备无引物（PF₂）的随机区段。自互补桥结构（self-bridge）可通过PF₁流程获得，或通过对起始文库使用Nt.BstNBI单酶切（b），再结合凝胶纯化获得。经过筛选（c）后，将筛选出的序列（命名为pS30）与其对应的寡核苷酸链及自互补桥结构杂交，并连接以重新生成先前被去除的引物区域。与PF₁方法相同，在引物中引入在3'-端含有Sp6启动子的序列（d）。随后利用该结构转录生成包含筛选序列的RNA（e）。接着仅使用RT-PCR对RNA进行再扩增（f），所得筛选后的亚文库即可用于下一轮筛选。

图2. PF筛选流程的示意图及实验结果/实际验证。 标注的步骤与图1中所示步骤相对应。在用限制性内切酶（如图所示）消化通过PCR构建的PF文库后（步骤a），在变性条件下通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离消化产物。图中显示了采用PF₁和PF₂筛选方案获得的相应片段（步骤b）。筛选后（步骤c），结合的适配体与其对应的寡核苷酸及自桥接结构杂交，并连接以重新生成先前被去除的引物区域。在3'-端引入含有Sp6启动子的引物（步骤d）。使用5 μL反应体系中取1、0.5、0.25、0.125 μL连接产物进行转录，获得³²P标记的RNA，并在变性条件下通过6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（步骤e）。转录产物随后用DNase处理以去除未被筛选的随机DNA区域，反转录为cDNA，再进行7、14、21或28个PCR循环的重新扩增。产物在非变性条件下通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。66 nt片段代表全长产物，其中包含重新嵌入5'和3'侧翼序列中的筛选所得pS30-CC和pS30序列。左侧显示PhiX174/HinfI分子量标记物的迁移位置（步骤f）。对照组中省略了反转录（RT）步骤。在高循环数下，此类样本中可见少量产物；这可能通过第二次（或延长的）DNase消化步骤完全消除。

图3. 所选适配体的结合特性及其在夹心结构中的配对使用。
A. 用于测定解离常数（Kd）的³²P-适配体浓度依赖性结合。适配体通过γ-³²P-ATP（3000 Ci/mmol，约10 mCi）和T4多核苷酸激酶（New England Biolabs）进行5'端标记，结合实验按前述方法进行测定。

B. 5'-氨基修饰的1^st 适配体被偶联至Codelink微阵列。纯化的S100B蛋白被结合到1^st 适配体，载玻片被彻底冲洗，然后加入AlexaFluor546标记的2^nd 适配体与1结合^st 适配体：S100B 复合物。充分洗涤后，使用 ScanArray 扫描仪定量荧光信号。

C. 5'-硫醇修饰的1^st 采用标准的巯基化学方法将适配体偶联到金纳米线上。2^nd 适配体以相同方式偶联到50 nm AuNPs上。随后，纯化的S100B蛋白（左）或纯化的HtrA1对照蛋白（右）首先与衍生化纳米线结合。充分洗涤后，2^nd 适配体-50 nm AuNPs 随后与 1 结合^st-适配体-纳米线：S100B 复合物。充分洗涤后，利用场发射扫描电子显微镜观察结合的夹心复合物。比例尺 = 1 μm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris-HCl
HotMaster TAQ DNA 聚合酶	5 PRIME
dNTP 混合液	Sigma-Aldrich
丙烯酰胺	Fisher Scientific
UltraPure 10X TBE 缓冲液	Invitrogen
过硫酸铵	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
PhiX174 DNA/Hinf I DNA 标记物	Promega Corp.
溴化乙锭
α-32P-dCTP
苯酚:ChCl3:IAA	Ambion
NaCl
乙醇
限制性内切酶	New England Biolabs
尿素	Fisher Scientific
X射线胶片	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Ni-NTA 琼脂糖珠	Qiagen
聚丙烯柱	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Detroit-551 细胞
SK-MEL-31 细胞
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs
二甲基亚砜	Promega Corp.
Sp6 RNA 聚合酶	Promega Corp.
无RNase的DNase I	Promega Corp.
RNase抑制剂	Promega Corp.
SensiScript 逆转录酶	Qiagen
pCR-2.1-TOPO 载体	Invitrogen
DH5α 感受态细胞	Invitrogen
质粒小提试剂盒	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs
γ-32P-ATP