在动物研究中，药物自我给药和超声波发声（USV）常被用作行为评估手段，但很少联合使用。本文旨在阐述在药物自我给药过程中记录超声波发声的优势，以评估个体对药物体验的情感反应。
本文内容
摘要
摘要
药物自我给药程序常用于研究与人类药物滥用、成瘾及复吸相关的行为和神经化学变化。在动物研究中，通常采用多种行为活动作为评估药物动机的指标。然而，在戒断期可卡因使用者中，药物复吸的一个关键成分是“药物渴求”，这种状态在动物模型中较难模拟，因其常在缺乏明显外在行为表现的情况下发生。不过，大鼠的一类超声波发声（USVs）可能成为反映对药物给予、药物预期甚至药物渴求所产生情感反应的有用指标。大鼠会发出超声频率的叫声，具有交流功能，并表达主观情绪状态。多项研究表明，不同频率范围的叫声与负面或正面情绪状态相关。例如，高频叫声（“50-kHz”）与积极情绪相关，而低频叫声（“22-kHz”）则代表负面情绪状态。本文描述了一种用于评估大鼠在每日可卡因自我给药过程中伴随超声波发声的实验方法。在该方法中，我们使用安置于隔音箱内的标准单杠杆操作箱进行可卡因自我给药实验，并采用超声麦克风、多通道录音硬件及专用软件程序来检测和分析超声波发声。超声波发声的测量可反映药物可获得性前后及期间大鼠的情绪状态，并可与常规评估的药物自我给药行为数据（如压杆反应、反应间间隔和运动活动）进行关联分析。由于超声波发声可在药物可获得前的时段（例如预期性发声）以及药物消除试验期间进行检测，因此也可用于确定与药物预期和药物戒断相关的情绪变化。此外，分析短期和长期药物暴露过程中超声波发声的变化，可更详细地阐释药物暴露对情绪功能的影响。
方案
*= 重要提示
- 经过良好适应的雄性Sprague-Dawley大鼠被训练通过按压杠杆获取食物奖励（45 mg蔗糖颗粒；Bio-Serv，Frenchtown，NJ）。
- *静脉导管由不锈钢套管（Plastics One，VA）和硅胶管构成。大鼠接受颈静脉插管手术，以实现药物自我给药。术后，通过每日注射0.1 ml含0.9%生理盐水、肝素和替莫西林（Timentin）的溶液维持导管通畅。
- 本实验所用的可卡因（NIDA药物库存与供应控制项目；RTI International，Research Triangle Park，NC）根据动物体重溶解于等渗生理盐水（0.9%）中，配制成适当剂量浓度（0.75 mg/kg/次注射），每次注射体积为0.1 ml。对照组动物接受相同体积的生理盐水注射。
- *用于药物自我给药的装置包括一个单杠杆操作箱（28 × 22 × 21 cm），配备有环境灯和刺激灯以及三组光束传感器。操作箱置于一个更大的隔音箱内（Med Associated，St. Albans，VT），以减少外界噪音和光线干扰。在给药期间，动物通过导管与安装在电机驱动泵（Razel Scientific Instruments，Model A，St. Albans，VT）上的注射器相连，注射器内含有可卡因溶液（0.75 mg/kg/次注射）或无菌生理盐水。每次按压杠杆后，杠杆上方的刺激灯亮起，并在6秒内完成一次药物或生理盐水输注。运动活动性通过光束中断次数进行评估。药物自我给药程序由配备Med PC软件的Med Pentium计算机（Med Associates）进行控制，并记录行为反应（如按压杠杆次数和运动活动性）。
- *为检测和记录超声发声（USVs），需要使用超声麦克风、数据采集硬件、录音软件（Avisoft Bioacoustics，Berlin，Germany）和PC计算机系统。在本实验中，超声麦克风（频率响应范围=10–100 kHz）牢固安装在操作箱中央。麦克风连接至操作箱外的数据采集硬件（Avisoft-Ultrasoundgate），并通过RECORDER多通道录音软件（Avisoft Bioacoustics）在PC计算机系统（Dell Optiplex GX270，Windows XP Professional，Intel(R) Pentium(R) 4 CPU，2.60 GHz，1 GB RAM）上进行录音采集。
- *每次药物自我给药/USV录音会话按以下步骤进行：
- 将动物从饲养笼中轻柔取出，并用0.05 ml肝素化生理盐水冲洗其留置静脉导管，以检测可能的导管功能异常。
- *将大鼠连接至操作箱上安装的旋转连接器，以便在自我给药期间给予药物或溶剂。动物被轻柔放入操作箱后，箱门安静关闭。药物自我给药程序（Med PC）与USV录音软件（RECORDER）运行于两台独立的计算机系统上。因此，为实现操作箱内行为与USV检测的同步关联，两个程序必须同时启动（根据计算机位置，可能需要两人操作）。
- *个体USVs在整个会话期间被连续记录并打上时间戳。控制和记录操作箱内事件的MedPC程序可根据具体需求进行编写。MedPC程序在会话结束时自动关闭，而USV录音需在专用的USV录音计算机系统上手动停止。
- 会话结束后，将动物从操作箱中轻柔取出，断开与旋转连接器的连接，并用0.05 ml肝素化生理盐水冲洗导管，以清除残留药物。
- *出于操作便利性考虑，我们使用了一台独立的计算机系统进行USV分析（Dell Optiplex 745，Windows XP Professional，Intel(R) Core(TM) 2 CPU，2.40 GHz，2 GB RAM），但分析软件也可安装在与录音软件相同的计算机系统上。USV分析必须谨慎进行以确保准确性：
- *SASLab Pro分析软件（Avisoft Bioacoustics，Berlin，Germany）可将记录的USVs以声谱图形式呈现，供研究人员同时观察和聆听。
- *利用可用的配置设置，可根据个人偏好调整生成的声谱图。此外，可切除低频段的背景噪声（例如由操作箱风扇产生的噪声），使软件能够自动检测声谱图中高于该频率的声音。这些功能有助于缩短声音文件长度并加快数据分析速度。
- 有时在与USVs相同频率范围内也会在声谱图中检测到背景噪声。由于声音文件以.wav格式记录，研究人员在分析过程中需听取声音文件，以确认并区分USVs与背景噪声。
- *分析软件可生成包含呼叫频率、带宽、持续时间以及USV发出精确时间等参数的Excel文件。后者允许将USVs与自我给药前后的确切时间点相关联，从而使USVs可作为实验过程中特定时刻大鼠情绪反应的实时测量指标。
代表性结果：
图 1：22 kHz 范围超声波发声（USV）的频谱图显示。 在伴随厌恶性刺激时诱发的 22 kHz 范围内的长时程发声，被认为反映了一种负面情绪状态。
图 2：50-kHz 超声发声（USVs）的频谱图显示。 在预期和可卡因自我给药期间诱发短暂的“平坦型”和“频率调制型”50-kHz 超声发声（USVs），这些发声与积极情绪相关。
图3：可卡因诱导的大鼠50-kHz范围超声发声（USVs）。 该图显示了一只典型大鼠在可卡因自我给药实验第5天，于自我注射可卡因（0.75 mg/kg/次）前后诱发的超声发声（以10秒为时间窗）。在放入操作箱后、尚未获得可卡因之前，记录到可卡因预期相关的USVs；在自我给药过程中，则记录到可卡因诱导产生的USVs。
讨论
大鼠会发出具有社交和交流功能并表达主观情绪状态的超声波叫声1,2。22-kHz超声波叫声（USVs）可由引发焦虑和痛苦的事件诱发，例如足底电击提示、捕食者出现、厌恶性药物以及社会挫败2,3。因此，这些通常较长的超声波叫声（>0.3s）被认为反映了动物的负面情绪状态。相反，较短的50-kHz超声波叫声（>0.3s）则在积极社交互动期间或预期发生时发出，例如进食、交配和社会性游戏，因而与动物的积极情绪状态相关2,4。这些叫声还与多巴胺能系统的激活相关的强化事件有关5。例如，系统性注射可卡因6或右旋苯丙胺（d-amphetamine）7，以及先前与滥用药物配对过的环境，均可诱发50-kHz超声波叫声的增加8-10。
有研究提出，啮齿类动物运动活动的增加与动机增强和趋近行为相关11-14。然而，这种关联至多只是间接的。通过研究特定频率超声波发声（USVs）的出现及其持续情况，可深入了解药物体验不同方面所产生的情绪效应。
在此实验设置中，我们在药物自我给药实验开始前及进行期间立即采集了超声 vocal 声（USV）记录。这使我们能够考察在实验开始前的无药物间隔期内药物预期的形成过程，并评估可卡因对 USV 的直接作用。药物自我给药方法使大鼠能够自主控制其药物摄入水平，并形成对药物给予时间与频率的准确预期。因此，在这些实验期间检测到的 USV 反映了对药物递送的准确预期。此外，还可以在药物不可获得的间隔期（例如，预期性 USV）、接受实验者给药的大鼠中以及药物消除试验期间评估 USV。因此，与药物预期、非依赖性药物给予及药物戒断相关的感情状态变化也可被确定。对短期和长期药物暴露过程中 USV 变化的分析，可为药物暴露对情感功能影响提供更详细的解释。
除了药物自我给药实验外，操作箱中的超声波发声记录还可用于多种与奖赏或厌恶相关的行为操作，例如酒精摄入、食物强化以及恐惧条件化和消退实验。
重要的方法学细节
由于MedPC软件可用于精确操控实验条件（如杠杆可用性和光照条件），将其与超声波发声（USV）记录和分析相结合，能够区分药物相关线索呈现（例如光刺激或其他感觉刺激）引起的情绪效应与药物摄入的直接效应。因此，为确保自我给药程序与USV记录的时间线完全重叠，每次实验开始时必须同时启动两个软件程序（例如MedPC和RECORDER）。
由于存储超声 vocalization（USV）数据需要大量的数字存储空间（例如，一个10分钟的音频文件大约需要250 MB），当在同一台计算机系统上同时对多只动物进行实验时，必须格外谨慎。为避免记录错误，记录用计算机系统的内存容量应足够大（1-2 GB）。其他减少记录错误的方法包括在记录过程中降低USV的分辨率和/或减少同时实验的动物数量。此外，研究人员在整个实验过程中必须密切关注数据采集的各个方面。例如，硬盘上积累大量记录数据可能导致USV记录程序暂停。此时，必须立即重新启动记录程序，以避免USV数据丢失以及USV与其他行为测量指标之间的不同步。
环境条件可能影响动物发出超声波叫声（USV）。例如，被不熟悉的人触摸可能导致动物发出表示负面情绪的22-kHz叫声，这可能被误认为是对实验条件的厌恶。因此，在进行实验操作前进行充分的抓握训练是行为学实验中的重要环节。此外，由于新环境也可能引发非特异性的超声波叫声，因此应尽可能让动物在测试环境进行适应。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 RO1DA014640 和 3R01DA014640-05S1、德克萨斯大学研究副校长办公室（C.L.D）、国家药物滥用研究所（NIDA）药物供应计划以及德克萨斯大学 Waggoner 酒精与成瘾研究中心 Bruce-Jones 研究生奖学金（E.Y.M）资助。我们感谢 Leah McAleer、Mohamed Abdalla、Neha Thakore、Byron Barksdale、Tiffany Nguyen、Tian Tian、Hunter Owen、Proy Phongsawad、Helen Reed、Rachel Chavana、Linda Ju 和 Rosie Maddox 在超声波发声（USV）数据分析方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠操作性条件行为（药物自我给药）测试套装 |  Med Associates, Inc. | MED-008-CT-B1 | |
| 红外光源与探测器（光束） | Med Associates, Inc. | ENV-253SD ENV-253 | |
| Med PC 软件 | Med Associates, Inc. | SOF-735 | |
| 单速注射泵 | Razel Scientific Instruments | Model R-E | |
| 45 mg 蔗糖颗粒 | Bio-Serv | F0042 | |
| 导管套管 | Plastics One | C313G-5UP | |
| Avisoft-UltraSoundGate 416H | Avisoft BioAcoustics | Part #34163 | |
| 超声麦克风 | Avisoft BioAcoustics | Part #40011 | |
| Avisoft-RECORDER 软件 | Avisoft BioAcoustics | Part #10302 | |
| Avisoft-SASLab 软件 | Avisoft BioAcoustics | Part #10101 | |
| 用于 USV 记录的 PC 计算机 | Dell | ||
| 用于 USV 数据分析的 PC 计算机 | Dell | ||
| 可卡因 | RTI International |
参考文献
- Brudzynski, S. M. Communication of adult rats by ultrasonic vocalization: biological, sociobiological, and neuroscience approaches. ILAR J. 50 (1), 43-43 (2009).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. Ultrasonic vocalizations as indices of affective states in rats. Psychol Bull. 128 (6), 961-961 (2002).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Maternal care, isolation-induced infant ultrasonic calling, and their relations to adult anxiety-related behavior in the rat. Behav Neurosci. 122 (2), 310-310 (2008).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. Anticipation of play elicits high-frequency ultrasonic vocalizations in young rats. J Comp Psychol. 112 (1), 65-65 (1998).
- Burgdorf, J., Panksepp, J. The neurobiology of positive emotions. Neurosci Biobehav Rev. 30 (2), 173-173 (2006).
- Mu, P. Repeated cocaine exposure induces sensitization of ultrasonic vocalization in rats. Neurosci Lett. 453 (1), 31-31 (2009).
- Ahrens, A. M. Repeated intravenous amphetamine exposure: rapid and persistent sensitization of 50-kHz ultrasonic trill calls in rats. Behav Brain Res. 197, 205-205 (2009).
- Burgdorf, J. Neurobiology of 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats: electrode mapping, lesion, and pharmacology studies. Behav Brain Res. 182 (2), 274-274 (2007).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. High-frequency ultrasonic vocalizations index conditioned pharmacological reward in rats. Physiol Behav. 66 (4), 639-639 (1999).
- Anagnostaras, S. G., Schallert, T., Robinson, T. E. Memory processes governing amphetamine-induced psychomotor sensitization. Neuropsychopharmacology. 26 (6), 703-703 (2002).
- Ferrario, C. R. Neural and behavioral plasticity associated with the transition from controlled to escalated cocaine use. Biol Psychiatry. 58 (9), 751-751 (2005).
- Flagel, S. B., Robinson, T. E. Quantifying the psychomotor activating effects of cocaine in the rat. Behav Pharmacol. 18 (4), 297-297 (2007).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Locomotor behavior. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8), 1-1 (2007).
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