通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

摘要

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。

摘要

钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶¹钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程¹钙蛋白酶已被证实在多种病理过程中发挥作用，包括肌营养不良症、癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和多发性硬化症¹. 钙蛋白酶的调控机制复杂且尚未完全阐明。mRNA 和蛋白质水平与钙蛋白酶活性的相关性较差，这限制了基因或蛋白质表达技术在检测钙蛋白酶活性中的应用。本视频方案详细介绍了我们实验室开发的一种流式细胞术检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物 BOC-LM-CMAC，该底物可被钙蛋白酶特异性切割，从而实现对钙蛋白酶活性的检测。²在本视频中，使用 LSRII（BD Bioscience）检测固定或活体的小鼠 32Dkit 白血病细胞（单独存在或作为脾细胞群体的一部分）中的钙蛋白酶活性。结果显示，与正常的脾细胞相比，32Dkit 细胞的钙蛋白酶活性升高。

方案

准备试剂

注意：所有 PBS 均含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺

1. 检测试剂
   将20μM 7-氨基-4-氯甲基香豆素、叔丁氧羰基-亮氨酸-甲硫氨酸酰胺（BOC-LM-CMAC）加入室温 PBS 中。每份细胞悬液需要 2mL 检测试剂。
2. 1% 多聚甲醛（固定细胞用）
   用室温 PBS 稀释 4% 多聚甲醛储备液。每管 FACS 管中分装 1mL 1% 多聚甲醛。每种实验条件需要 3 支 FACS 管（例如：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059 需要 9 支 FACS 管）
3. PD150606（钙蛋白酶抑制剂）
   用 DMSO 重悬 PD150606，终浓度为 100mM。本试剂及所有经其处理的细胞在实验全程需避光保存。
4. PD98059（MEK1 抑制剂）
   用 DMSO 重悬 PD98059，终浓度为 50mM。

准备细胞

1. 在 Opti-MEM 培养基中培养 32Dkit 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清、WEHI-3 上清液作为 IL-3 来源（或使用其他 IL-3 ....

讨论

本视频方案中测定了固定和活体32Dkit细胞中的钙蛋白酶活性。使用钙蛋白酶抑制剂PD150606处理该细胞系，可完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。此外，使用MEK1抑制剂PD98059处理也能完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。ERK是钙蛋白酶-2的主要激活因子³。这些结果表明，钙蛋白酶-2的活性在32Dkit细胞中占主导地位。本实验室目前的研究正在探讨钙蛋白酶活性升高在白血病中的影响，以及钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在其中所起的作用。

本方案详细介绍了首个基于流式细胞术的检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中钙蛋白酶的活性水平，可用于在完整细胞中研究钙蛋白酶的调控机制及其在病理过程中的作用。

该方案可进行修改，以检测抑制剂或基因操作对钙蛋白酶活性的影响。此外，该检测方法可用于测量脐血等复杂细胞混合物中的钙蛋白酶活性，或用于鉴定和测量从脾脏分离的特定细胞亚群中的钙蛋白酶活性。

该检测方法无法区分由不同钙蛋白酶异构体产生的活性。可使用基因或药物试剂敲低或抑制特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS BOC-LM-CMAC 4% 多聚甲醛	Invitrogen		将4 g多聚甲醛溶解于100 mL PBS中。在通风橱中加热样品并搅拌至澄清。 冷却后于4℃保存°C
PD150606	Invitrogen		使用 freshly reconstituted PD150606 以实现最大程度的钙蛋白酶抑制。
PD98059	细胞信号技术
AlignFlow，AlignFlow 加荧光微珠 FACS 管	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		WEHI-3 细胞的上清液在本实验中用作白细胞介素-3（IL-3）的来源。每次收集的 WEHI-3 上清液均需进行滴定，以确定用于 32Dkit 细胞生长的最佳浓度。