本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
钙蛋白酶是一类普遍存在的细胞内钙离子敏感性中性半胱氨酸蛋白酶1钙蛋白酶在多种生理过程中发挥关键作用，包括信号转导、细胞骨架重塑、基因表达调控、细胞凋亡以及细胞周期进程1钙蛋白酶已被证实在多种病理过程中发挥作用，包括肌营养不良症、癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和多发性硬化症1. 钙蛋白酶的调控机制复杂且尚未完全阐明。mRNA 和蛋白质水平与钙蛋白酶活性的相关性较差，这限制了基因或蛋白质表达技术在检测钙蛋白酶活性中的应用。本视频方案详细介绍了我们实验室开发的一种流式细胞术检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中的钙蛋白酶活性。该方法利用荧光底物 BOC-LM-CMAC，该底物可被钙蛋白酶特异性切割，从而实现对钙蛋白酶活性的检测。2在本视频中，使用 LSRII（BD Bioscience）检测固定或活体的小鼠 32Dkit 白血病细胞（单独存在或作为脾细胞群体的一部分）中的钙蛋白酶活性。结果显示，与正常的脾细胞相比，32Dkit 细胞的钙蛋白酶活性升高。
方案
准备试剂
注意：所有 PBS 均含有 Ca2+ 和 Mg2+
- 检测试剂
将20μM 7-氨基-4-氯甲基香豆素、叔丁氧羰基-亮氨酸-甲硫氨酸酰胺（BOC-LM-CMAC）加入室温 PBS 中。每份细胞悬液需要 2mL 检测试剂。 - 1% 多聚甲醛（固定细胞用）
用室温 PBS 稀释 4% 多聚甲醛储备液。每管 FACS 管中分装 1mL 1% 多聚甲醛。每种实验条件需要 3 支 FACS 管（例如：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059 需要 9 支 FACS 管） - PD150606（钙蛋白酶抑制剂）
用 DMSO 重悬 PD150606，终浓度为 100mM。本试剂及所有经其处理的细胞在实验全程需避光保存。 - PD98059（MEK1 抑制剂）
用 DMSO 重悬 PD98059，终浓度为 50mM。
准备细胞
- 在 Opti-MEM 培养基中培养 32Dkit 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清、WEHI-3 上清液作为 IL-3 来源（或使用其他 IL-3 来源，如重组蛋白）、0.1% 2-巯基乙醇和抗生素，细胞密度维持在每毫升 5 × 105 至 1 × 106 个细胞。
- 将 12 × 106 个 32Dkit 细胞分装至三个 15 mL Falcon 管中，每管 4 × 106 个细胞。
- 在 15°C 下以 1000 RPM 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 吸除上清液，将细胞重悬于 2 mL 室温 PBS 中。
- 向其中一份细胞悬液中加入 50 μM PD150606。用铝箔包裹 Falcon 管以避光，短暂涡旋后于室温避光孵育 20 至 30 分钟。
- 向第二份细胞悬液中加入 20 μM PD98059。将细胞接种至 35 mm 组织培养皿中，在 37°C 孵育 2 小时。
固定细胞中的钙蛋白酶活性检测
- 在样品与PD150606孵育的同时，开始对未经处理的样品进行钙蛋白酶活性检测。首先向每份细胞悬液中加入2 mL检测试剂。立即将1 mL细胞悬液与检测试剂的混合液加入预先准备好的含有1%多聚甲醛的FACS管中（对应0分钟时间点）。
- 将细胞悬液与检测试剂在室温下孵育5分钟。然后取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。
- 继续将细胞悬液与检测混合物在室温下额外孵育5分钟。随后再取1 mL细胞悬液加入另一FACS管中，其中含有1 mL 1%多聚甲醛。
- 对经抑制剂处理的32Dkit细胞重复上述钙蛋白酶活性检测步骤。
- 将细胞在4°C避光条件下固定过夜。
- 次日，在15°C下以1800 RPM离心5分钟收集细胞。
- 吸除上清液，将细胞重悬于750 µL PBS中。将细胞置于冰上并避光保存。
获取固定细胞的数据
- 使用 LSR II（BD Bioscience）分析细胞。设置 Lightwave Xcyte（UV）激光器的参数：激发波长 355 nm，激光功率 25 mW，底物和产物的发射波长分别为 405 nm 和 450 nm。底物和产物的带通滤光片分别为 405/20 和 450/50，长通滤光片分别为 405 和 450。底物和产物的 PMT 电压分别设置为 350–375 和 325–350。
- 在 BD FACSDiva 软件中设置实验参数：前向散射光；侧向散射光；Indo-1 蓝色（对数）；Indo-1 紫色（对数）。在工作表中设置以下图形：前向散射光与侧向散射光的点图，并在活细胞上设门（图 1a），Indo-1 蓝色直方图，Indo-1 紫色直方图，Indo-1 蓝色与 Indo-1 紫色的点图。
- 使用 AlignFlow 和 AlignFlow plus 荧光微球（Invitrogen）对 LSR II 进行校准。每次实验前应调整 PMT 电压，使微球荧光直方图的峰值位于相同的通道。
- 从 0 分钟时间点开始，使用 32Dkit 细胞采集数据。根据需要调整参数电压。每份样品采集并记录 10,000 个事件。
- 对每份样品重复采集，在每管之间用 FACS 缓冲液冲洗仪器。
- 导出数据。确保按照机构指南清洁 LSR II 仪器。
活细胞中钙蛋白酶活性检测
- 按上述方法制备细胞悬液，但不加入PD150606。将样品转移至LSR II流式细胞仪，按上述设置滤光片和参数。按上述方法设置工作表。包含一个显示Indo-1 Blue与时间关系的大型点图。将程序设置为采集最大数量的事件（无停止门控）。
- 向一份32Dkit细胞悬液中加入50μM PD150606。将样品避光保存，在室温下孵育20-30分钟。
- 开始采集未添加PD150606的32Dkit细胞悬液数据。使用较低流速，每秒200-300个事件。在采集30秒至1分钟后，将样品管从仪器中取出。向细胞中加入20μM BOC-LM-CMAC，短暂涡旋混匀后继续采集数据。
- 持续采集数据10-20分钟，或直至钙蛋白酶活性达到平台期。
- 对经PD150606处理的32Dkit细胞重复步骤3和4。
- 导出数据。确保按照机构指南清洁LSR II流式细胞仪。
复杂（混合）细胞群体中的钙蛋白酶活性检测
*本实验将鉴定从小鼠脾脏提取的细胞悬液中的32Dkit细胞。
- 取出每只小鼠的脾脏。在室温下用 NH4Cl 裂解红细胞 10 分钟。
- 在 2 mL PBS 中制备单细胞悬液。
- 将每份细胞悬液分为两份。其中一份用 50 μM PD150606 在室温避光处理 20–30 分钟。
- 按照上述“固定细胞中钙蛋白酶活性检测”（步骤 1–6）的操作继续进行。
- 吸去上清液。用 500 μL PBS 洗涤细胞，吸去上清液。
- 将细胞重悬于含 2% BSA 的 200 μL 染色缓冲液中，在室温孵育 15 分钟。
- 配制一抗（FITC 标记的抗小鼠 CD117 抗体），使用染色缓冲液按 1:200 稀释。确保抗体避光保存。
- 向细胞中加入 200 μL 一抗，在室温避光孵育 30 分钟。
- 加入 400 μL PBS 以增加体积，用于流式细胞术检测。将细胞置于冰上并避光保存。
- 按照“固定细胞数据采集”部分所述步骤操作。在检测参数中添加 FITC，并在工作表中包含 FITC 的直方图。
分析与代表性结果
- 使用 FlowJo (Treestar) 分析数据。根据前向散射和侧向散射图谱对活细胞设门（图 1a）。从活细胞门中确定 Indo-Blue 的平均荧光强度（图 1b）。
- a) 对于混合细胞群体
- 在直方图和点图中使用 FITC 荧光识别 32Dkit 细胞群
- 确定 32Dkit 细胞群 Indo-Blue 的平均荧光强度
- 使用 Microsoft Excel 绘制平均荧光强度曲线（图 2a）。计算 5 至 10 分钟之间直线的斜率。以柱状图形式绘制斜率，以评估细胞中钙蛋白酶活性（图 2b）。
图 1a. 基于前向散射和侧向散射特征确定活细胞。
图1b. 10分钟时间过程中平均荧光强度的变化。
图 2a. 平均荧光强度的代表性图谱。
图2b. 32Dkit细胞中加入抑制剂后的钙蛋白酶活性。
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讨论
本视频方案中测定了固定和活体32Dkit细胞中的钙蛋白酶活性。使用钙蛋白酶抑制剂PD150606处理该细胞系，可完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。此外，使用MEK1抑制剂PD98059处理也能完全抑制细胞中的钙蛋白酶活性。ERK是钙蛋白酶-2的主要激活因子3。这些结果表明，钙蛋白酶-2的活性在32Dkit细胞中占主导地位。本实验室目前的研究正在探讨钙蛋白酶活性升高在白血病中的影响，以及钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2在其中所起的作用。
本方案详细介绍了首个基于流式细胞术的检测方法，用于测定固定细胞和活细胞中钙蛋白酶的活性水平，可用于在完整细胞中研究钙蛋白酶的调控机制及其在病理过程中的作用。
该方案可进行修改，以检测抑制剂或基因操作对钙蛋白酶活性的影响。此外，该检测方法可用于测量脐血等复杂细胞混合物中的钙蛋白酶活性，或用于鉴定和测量从脾脏分离的特定细胞亚群中的钙蛋白酶活性。
该检测方法无法区分由不同钙蛋白酶异构体产生的活性。可使用基因或药物试剂敲低或抑制特...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由加拿大卫生研究院、加拿大白血病与淋巴瘤协会以及加拿大淋巴瘤基金会的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% 多聚甲醛 | Invitrogen | 将4 g多聚甲醛溶解于100 mL PBS中。在通风橱中加热样品并搅拌至澄清。 冷却后于4℃保存°C | |
| PD150606 | Invitrogen | 使用 freshly reconstituted PD150606 以实现最大程度的钙蛋白酶抑制。 | |
| PD98059 | 细胞信号技术 | ||
| AlignFlow，AlignFlow 加荧光微珠 FACS 管 | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | WEHI-3 细胞的上清液在本实验中用作白细胞介素-3（IL-3）的来源。每次收集的 WEHI-3 上清液均需进行滴定，以确定用于 32Dkit 细胞生长的最佳浓度。 |
参考文献
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
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