从质粒DNA生成重组流感病毒

摘要

从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。

摘要

多个流感研究团队的努力在甲型流感病毒反向遗传学技术的发展与改进中起到了关键作用。该技术最初于1999年建立^1,2基于质粒的反向遗传学技术通过生成重组病毒，彻底改变了流感研究领域，因为利用基因工程改造的、具有感染性的重组流感病毒，已经解答了许多特定的科学问题。此类研究包括病毒复制机制、病毒蛋白功能、病毒蛋白中特定突变对病毒复制和/或致病性的贡献，以及利用表达外源蛋白的重组流感病毒作为病毒载体的研究。³.

方案

1. 流感病毒拯救转染

甲型流感病毒属于负链RNA包膜病毒的Orthomyxoviridae科。甲型流感病毒基因组由8个不同节段的负链RNA基因组成，至少编码11种病毒蛋白（图1）⁴。本报告将重点介绍利用含有8个甲型流感病毒A/PR/8/34毒株基因片段的双义质粒（pDZ）来拯救最常用的实验室毒株之一——A/PR/8/34（图2）⁵。

为从质粒DNA中拯救重组流感病毒，我们建议每种重组病毒进行3次独立的转染。若尝试拯救多种重组病毒，应根据待拯救病毒的数量相应扩大以下步骤的规模。以下转染与感染方案适用于6孔板。该方案的示意图见图3。

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000（LPF2000）混合液：每转染反应准备250 μl OptiMEM培养基和6–8 μl LPF2000，在室温（RT）孵育5–10分钟。在此期间，准备质粒转染混合液。
2. 质粒转染混合液：在50 μl OptiMEM培养基中配制质粒转染混合物。我们通常每次病毒拯救使用每种流感DNA质粒1 μg。将1 μl浓度为1 μg/μl的pDZ质粒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS加入含有50 μl OptiMEM培养基的离心管中。
3. OptiMEM-LPF2000-DNA质粒混合液：将步骤1.1中的250 μl混合液加入流感DNA质粒转染混合液（步骤1.2）中，在室温孵育20–30分钟。在此期间，准备用于转染的293T和MDCK细胞悬液。
4. 293T/MDCK共培养体系的制备：开始前，将PBS 1X、含10%FBS和1%PS的DMEM培养基以及EDTA-胰蛋白酶混合液预热至37°C。转染当天，细胞密度应达到80–90%融合度。通常，一个融合的100 mm培养皿的293T细胞和一个融合的100 mm培养皿的MDCK细胞可用于10–12次病毒拯救。我们将每孔使用250 μl细胞悬液。两种细胞系均需重悬于总共3 ml含10%FBS和1%PS的DMEM培养基中。
   • 将每种细胞系小心地重悬于15 ml离心管中的10 ml含10%FBS和1%PS的DMEM培养基中。分别准备一个293T细胞管和一个MDCK细胞管。
   • 将293T细胞重悬于3 ml含10%FBS和1%PS的DMEM培养基中，待充分重悬后，将这3 ml液体转移至MDCK细胞中以重悬MDCK细胞。由此获得用于共培养的293T和MDCK细胞混合物。
   • 每孔（10–12个6孔板孔）加入250 μl 293T/MDCK细胞混合液。
5. 在室温孵育20–30分钟后（步骤1.3），向OptiMEM-LPF2000-流感DNA质粒混合液中加入1 ml含10%FBS和1%PS的DMEM培养基。
6. 将1.3 ml混合液（步骤1.5）加入含有250 μl 293T/MDCK细胞的孔中（步骤1.4）。
7. 轻轻摇动6孔板，将转染体系在37°C、5% CO₂培养箱中过夜（ON）孵育。
8. 次日，即转染后约16–24小时，更换转染培养基，并将转染后的细胞在含1 μg/ml TPCK-胰蛋白酶的DMEM 0.3%BA 1%PS培养基中继续孵育48小时。
9. 更换培养基48小时后，将转染细胞的上清液转移至微量离心管中。
10. 将组织培养上清液在微量离心机中以13,000 rpm离心1–2分钟。
11. 使用步骤1.10中离心后的200 μl组织培养上清液感染新鲜的MDCK细胞（前一天铺板）或10日龄鸡胚尿囊卵，将细胞和/或鸡胚在37°C孵育2–3天。
    1. 10日龄鸡胚尿囊卵的感染：所有感染鸡胚的操作均在无菌条件下进行。
       1. 使用照卵灯观察10日龄鸡胚，识别气室与尿囊腔之间的界面，并用铅笔标记界面边界。
       2. 用5 ml注射器针头在蛋壳上打孔。
       3. 使用1 ml注射器，向每个鸡胚注射200 μl步骤1.10中的组织培养上清液。
       4. 用棉签蘸取熔化的石蜡封住蛋壳上的孔。
       5. 将感染后的鸡胚在37°C孵育2–3天。
    2. 新鲜MDCK细胞的感染：在传代293T/MDCK共培养物的组织培养上清液前一天，准备6孔板MDCK细胞，使其在次日达到80–90%融合度。通常，一个融合的100 mm组织培养皿可分至6–8孔。用PBS 1X洗涤细胞两次，胰酶消化后接种至6孔板。手动轻轻摇动培养板，使细胞分布均匀。将细胞在37°C、5% CO₂培养箱中过夜（ON）培养。感染前在显微镜下检查细胞，确认形成单层后进行感染操作：
       • 用1 ml PBS 1X洗涤细胞两次。
       • 在室温下用200 μl离心后的组织培养上清液感染1小时，避免细胞干燥，每10分钟轻轻摇动6孔板一次。
       • 病毒吸附1小时后，移除MDCK细胞中的感染液，加入2 ml含1 μg/ml TPCK-胰蛋白酶的DMEM 0.3%BA 1%PS培养基。
       • 传代后48–72小时，根据转染效率和病毒载量，可在感染的MDCK细胞中观察到细胞病变效应（CPE）。CPE提示病毒拯救成功。然而，仍需进行血凝（HA）试验（第2节）以确认组织培养上清液中存在病毒。
12. 收获感染鸡胚的尿囊液：所有从感染鸡胚中收获尿囊液的操作均在无菌条件下进行。每个10日龄感染鸡胚可收获约8–12 ml尿囊液。在收获前，将鸡胚在4°C孵育2小时（或过夜），以杀死鸡胚并使血液凝固。
    • 用70%乙醇清洗蛋壳，建立无菌环境。
    • 用勺子轻敲气室区域小心打开蛋壳，用镊子移除破碎的蛋壳。
    • 用1 ml针头移除尿囊膜，注意不要破坏蛋黄。
    • 用刮勺固定鸡胚，将10 ml移液器插入尿囊腔中，尽可能多地收集尿囊液至置于冰桶中的预冷15 ml离心管中，避免破坏或收集蛋黄。每个鸡胚使用一个15 ml离心管。
    • 在4°C下离心5分钟，将尿囊液（避免吸取沉淀的红细胞）转移至新的15 ml离心管中。
    • 将含有离心后尿囊液的离心管保存于4°C，直至通过血凝（HA）试验检测其中是否存在拯救出的病毒。

2. 确认重组流感病毒拯救的HA试验

血凝试验（HA）常规用于检测 rescued 病毒在 MDCK 细胞培养上清液和/或收获的鸡胚尿囊液中的存在。也可采用免疫荧光试验（IFA）进行检测。一旦通过检测确认 rescued 病毒的存在，应对病毒进行蚀斑纯化，并通过 RT-PCR 和测序验证其基因组成。

可通过鸡（或其他来源）红细胞（RBC）的血凝（HA）试验宏观检测感染性鸡胚尿囊液和/或MDCK组织培养上清液中是否存在病毒。病毒的存在可引起红细胞发生血凝，而无病毒时则在孔底形成红色沉淀物（图4）。对于流感病毒，据认为约10³-10⁴ 蚀斑形成单位（PFU）需达到一定数量才能在血凝（HA）试验中产生阳性信号；因此，可平行进行免疫荧光试验（IFA）以确认真正的阴性结果。使用流感病毒特异性一抗进行的IFA比HA试验更为敏感，该技术可检测到少于10³–10⁴个病毒。因此，某些在HA试验中呈阴性的上清液或尿囊液可能在IFA中呈阳性。在此情况下，应通过再次在MDCK细胞或鸡胚中传代以扩增病毒。第二次传代后所得的尿囊液和/或组织培养上清液在HA试验中应呈现明确的阳性结果。

血凝试验在V型底96孔板中进行。每次血凝试验均应包含阴性对照（例如1X PBS）和阳性对照（流感病毒感染的组织培养上清液和/或尿囊液），以验证试验的有效性。

• 向V型底96孔板的每个孔中加入50 μl 1X PBS。
• 向第一孔中加入50 μl MDCK细胞培养上清液和/或来自感染鸡胚的尿囊液，并对后续各孔进行2倍系列稀释。从最后一孔弃去多余的50 μl。
• 向每个孔中加入50 μl 0.5%-1.0%的鸡红细胞（用1X PBS配制）。
• 将V型底96孔板置于冰上孵育30-45分钟（直至阴性对照PBS样品孔底部出现红色小点）。按照图4所示读取并解释结果。

3. 组织培养上清液的传代

HA 实验中出现阴性结果，可能是由于转染效率较低，导致组织培养上清液和/或尿囊液中病毒含量较低所致。将这些样本接种于新鲜的 MDCK 细胞和/或鸡胚中传代，可实现病毒的扩增（如图 3 所示）。感染操作按前文第 1.11.2 节所述方法进行。

4. 典型结果

流感病毒成功拯救将通过血凝试验（HA）呈阳性结果来确认（图4）。此外，感染组织培养上清液或鸡蛋尿囊液的细胞中出现细胞病变效应（CPE），也提示病毒拯救成功。

图 1. 流感病毒结构：流感病毒由脂质双层包被，其上含有两种病毒糖蛋白（HA、NA）以及离子通道蛋白 M2。HA 是病毒附着蛋白，负责与含唾液酸的受体结合。NA 负责病毒从宿主细胞的释放。在脂质双层下方，是由基质蛋白 M1 构成的蛋白层，M1 参与病毒颗粒的组装和出芽，以及核输出蛋白（NEP），后者是病毒核糖核蛋白复合物核输出所必需的。病毒的核心由核糖核蛋白（RNP）复合物组成，包含 8 条单链负链 RNA 病毒基因片段，这些基因片段被病毒核蛋白 NP 包裹。与 RNP 复合物结合的是病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶亚基 PA、PB1 和 PB2。非结构蛋白 NS1 和 PB1-F2 分别由 NS 和 PB1 基因片段编码，不属于病毒颗粒结构的一部分。

图2. 流感病毒拯救质粒： 标示出已克隆至双向性pDZ质粒中的八种流感病毒基因。pDZ质粒⁶源自蛋白表达质粒pCAGGs⁷，是一种双向质粒载体，含有一个人源RNA聚合酶I启动子和一个鼠源终止序列，用于编码负义基因组RNA；在与聚合酶I单元相反的方向上，含有一个聚合酶II转录盒（鸡β-肌动蛋白启动子和polyA），用于从同一病毒基因编码病毒蛋白。通过RT-PCR使用含有SapI限制性内切酶位点及各病毒片段非编码区（病毒基因末端的黑色框）的正向和反向引物扩增获得各病毒片段的cDNA。将PCR产物克隆至经SapI消化的pDZ质粒中。

图 3. 基于八质粒的流感病毒拯救系统：包含 8 个流感病毒基因的 pDZ 质粒在 293T-MDCK 细胞共培养体系中进行悬浮共转染（第 1 天）。转染后 24 小时，更换不含 FBS 但含有 TPCK-胰蛋白酶的培养基（第 2 天）。换液后 48 小时，收集组织培养上清液，并用于感染 MDCK 细胞或 10 日龄鸡胚（第 4 天）。扩增后 48–72 小时，收集 MDCK 感染细胞的组织培养上清液或鸡胚的尿囊液，通过血凝试验（HA）检测病毒的存在（第 6 天）。若未检测到病毒，可将相同的上清液和/或尿囊液再次传代至新鲜的 MDCK 细胞和/或鸡胚中。

图 4. 血凝试验（HA）：病毒颗粒引起红细胞（RBC）的血凝现象可在肉眼观察下可见，是检测组织培养上清液和/或尿囊液中病毒颗粒的基础。尽管血凝试验无法区分具有感染性的病毒颗粒与已降解且失去感染能力的颗粒，但该试验仍是判断样本中是否存在病毒的良好指标。A）生物样本中病毒的缺失（上图）或存在（下图）通过反应孔底部是否有红细胞沉淀来判断。B）显示了一次血凝试验的代表性结果，分别为未检测到病毒水平（上图）或存在病毒（下图）的情况。

讨论

从质粒DNA中拯救重组流感病毒是一种简单直接的过程，一旦该方案在实验室中常规开展，操作便会变得顺利；但在初期，可能会出现多种问题。为成功获得病毒，必须具备高质量的质粒制备。细胞系（293T和MDCK）的妥善维护对于病毒拯救的成功至关重要。传统上，通过沉默突变的方式将遗传标签插入流感病毒基因编码质粒中。引入这种沉默突变并创建例如新的限制性酶切位点，可用于通过酶切方法区分野生型与重组流感病毒。因此，在扩增经空斑纯化的重组病毒后，应进行RT-PCR和测序分析，以确认所拯救病毒的性质。这些反向遗传学技术的发展以及从质粒成功拯救重组流感病毒的方法，将使您能够深入探究病毒生物学中的特定科学问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	11995-065	4°C 下保存°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	4°C 保存°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	4°C 下保存°C
TPCK-胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T-8802	-20℃保存°C
牛血清白蛋白（BA）	Sigma-Aldrich	A7979	4°C 下保存°C
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300-054	-20℃保存°C
青霉素/链霉素（PS）100X	Invitrogen	15140-122	-20℃保存°C
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30070.03	-20储存°C
V型底96孔板	Nalge Nunc International	249570
孵化中的鸡胚 10日龄的鸡胚可购自美国康涅狄格州北富兰克林32号公路106号富兰克林公地查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的无特定病原体禽类供应（SPAFAS）禽类产品与服务部门，邮编06254。将鸡胚在37℃下孵育°病毒感染前后对鸡胚的观察。在病毒感染前后，需对鸡蛋进行照蛋以确定胚胎的存活情况。在感染前后仔细检查死胚非常重要。感染前，死胚可通过缺乏血管以及胚胎无活动来轻易识别；照蛋时，活胚会表现出运动。感染后，死胚（可能与流感病毒感染相关）可通过尿囊液量减少且呈血性、整体外观较差而被轻易识别。感染后的鸡蛋应弃置于双层可高压灭菌袋中，并按照标准程序进行高压灭菌处理。 鸡红细胞（RBC） 鸡红细胞可从马里兰州切斯特敦市山谷路201号（邮编21620）Truslow Farms公司购买。4 ℃保存。°C. 进行血凝试验（HA试验）时，在50 ml离心管中用45 ml 1× PBS洗涤5 ml鸡红细胞。室温下以1000 rpm离心5分钟，小心弃去上清液，将沉淀的红细胞用1× PBS稀释至1:1000（终浓度为0.5–1.0%红细胞）。 组织培养上清液和尿囊液 组织培养上清液和羊水均可在4℃下保存°短暂孵育。确认病毒拯救后，收集细胞上清液或羊水中的病毒，并于 -80 ℃ 保存。°C. 质粒 所有质粒均按照生产商说明，使用质粒大提试剂盒制备’s 的建议。所有质粒均分装为 1 的浓度 μg/ml 在 ddH₂O 中2O 并在 -20 保存°C. 短期保存时，质粒可置于4℃保存°C. 通过在260 nm处进行分光光度法测定纯化后的DNA质粒浓度，并利用260:280 nm比值评估其纯度。260:280 nm比值在1.8–2.0之间的样品被认为适用于病毒拯救实验。此外，应通过琼脂糖凝胶电泳确认质粒的浓度和纯度。图2展示了含有甲型流感病毒A/PR/8/34八个病毒基因的双义性pDZ质粒（6）（7）。 病毒 所述拯救流感病毒A/PR/8/34的实验方案可在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。受污染的材料，包括组织培养上清液和鸡胚，应在丢弃前进行灭菌处理。拯救其他流感病毒可能需要更高级别的生物安全条件，因此必须遵循相应的特殊条件或安全防护措施。 组织培养基与溶液 DMEM 10%FBS 1%PS：445 ml DMEM’s 改良的 Eagle’s 培养基（DMEM）、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100X 青霉素/链霉素（PS）。4℃ 保存°C. 该培养基将用于维持293T和MDCK细胞以及转染实验。DMEM 0.3%BA 1%PS：495.7 ml DMEM，4.3 ml 35% 牛血清白蛋白（BA）。4 ℃保存°C. 使用前，加入TPCK处理的胰蛋白酶，使其终浓度为1 μg/ml。感染性培养基。 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）：80 g NaCl，2 g KCl，11.5 g Na2HPO4.7H2O，2 g KH2PO4. 加入ddH₂O2加水至1升，调节pH至7.3，高压灭菌，室温保存。 1X PBS：将10X PBS用ddH₂O按1:10比例稀释2O. 高压灭菌后室温保存。