从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。
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本文内容
摘要
摘要
多个流感研究团队的努力在甲型流感病毒反向遗传学技术的发展与改进中起到了关键作用。该技术最初于1999年建立1,2基于质粒的反向遗传学技术通过生成重组病毒，彻底改变了流感研究领域，因为利用基因工程改造的、具有感染性的重组流感病毒，已经解答了许多特定的科学问题。此类研究包括病毒复制机制、病毒蛋白功能、病毒蛋白中特定突变对病毒复制和/或致病性的贡献，以及利用表达外源蛋白的重组流感病毒作为病毒载体的研究。3.
方案
1. 流感病毒拯救转染
甲型流感病毒属于负链RNA包膜病毒的Orthomyxoviridae科。甲型流感病毒基因组由8个不同节段的负链RNA基因组成，至少编码11种病毒蛋白（图1）4。本报告将重点介绍利用含有8个甲型流感病毒A/PR/8/34毒株基因片段的双义质粒（pDZ）来拯救最常用的实验室毒株之一——A/PR/8/34（图2）5。
为从质粒DNA中拯救重组流感病毒，我们建议每种重组病毒进行3次独立的转染。若尝试拯救多种重组病毒，应根据待拯救病毒的数量相应扩大以下步骤的规模。以下转染与感染方案适用于6孔板。该方案的示意图见图3。
- OptiMEM-Lipofectamine 2000（LPF2000）混合液：每转染反应准备250 μl OptiMEM培养基和6–8 μl LPF2000，在室温（RT）孵育5–10分钟。在此期间，准备质粒转染混合液。
- 质粒转染混合液：在50 μl OptiMEM培养基中配制质粒转染混合物。我们通常每次病毒拯救使用每种流感DNA质粒1 μg。将1 μl浓度为1 μg/μl的pDZ质粒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS加入含有50 μl OptiMEM培养基的离心管中。
- OptiMEM-LPF2000-DNA质粒混合液：将步骤....
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讨论
从质粒DNA中拯救重组流感病毒是一种简单直接的过程，一旦该方案在实验室中常规开展，操作便会变得顺利；但在初期，可能会出现多种问题。为成功获得病毒，必须具备高质量的质粒制备。细胞系（293T和MDCK）的妥善维护对于病毒拯救的成功至关重要。传统上，通过沉默突变的方式将遗传标签插入流感病毒基因编码质粒中。引入这种沉默突变并创建例如新的限制性酶切位点，可用于通过酶切方法区分野生型与重组流感病毒。因此，在扩增经空斑纯化的重组病毒后，应进行RT-PCR和测序分析，以确认所拯救病毒的性质。这些反向遗传学技术的发展以及从质粒成功拯救重组流感病毒的方法，将使您能够深入探究病毒生物学中的特定科学问题。
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披露
西奈山医学院在重组流感病毒领域拥有知识产权，AG-S 是该知识产权的发明人之一。
致谢
作者感谢Adolfo García-Sastre和Peter Palese实验室的历任及现任成员在流感病毒反向遗传学技术及质粒开发方面所做的贡献。AG-S实验室的研究工作部分由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助的流感研究与监测卓越中心（CRIP，项目编号HHSN266200700010C）以及NIAID基金项目R01AI046954、U01AI070469和P01AI058113资助。LM-S实验室的研究工作部分由NIAID基金项目RO1AI077719资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11995-065 | 4°C 下保存°C |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-034 | 4°C 保存°C |
| Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | 4°C 下保存°C |
| TPCK-胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T-8802 | -20℃保存°C |
| 牛血清白蛋白（BA） | Sigma-Aldrich | A7979 | 4°C 下保存°C |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | -20℃保存°C |
| 青霉素/链霉素（PS）100X | Invitrogen | 15140-122 | -20℃保存°C |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.03 | -20储存°C |
| V型底96孔板 | Nalge Nunc International | 249570 | |
孵化中的鸡胚 10日龄的鸡胚可购自美国康涅狄格州北富兰克林32号公路106号富兰克林公地查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的无特定病原体禽类供应（SPAFAS）禽类产品与服务部门，邮编06254。将鸡胚在37℃下孵育°病毒感染前后对鸡胚的观察。在病毒感染前后，需对鸡蛋进行照蛋以确定胚胎的存活情况。在感染前后仔细检查死胚非常重要。感染前，死胚可通过缺乏血管以及胚胎无活动来轻易识别；照蛋时，活胚会表现出运动。感染后，死胚（可能与流感病毒感染相关）可通过尿囊液量减少且呈血性、整体外观较差而被轻易识别。感染后的鸡蛋应弃置于双层可高压灭菌袋中，并按照标准程序进行高压灭菌处理。 鸡红细胞（RBC） 鸡红细胞可从马里兰州切斯特敦市山谷路201号（邮编21620）Truslow Farms公司购买。4 ℃保存。°C. 进行血凝试验（HA试验）时，在50 ml离心管中用45 ml 1× PBS洗涤5 ml鸡红细胞。室温下以1000 rpm离心5分钟，小心弃去上清液，将沉淀的红细胞用1× PBS稀释至1:1000（终浓度为0.5–1.0%红细胞）。 组织培养上清液和尿囊液 组织培养上清液和羊水均可在4℃下保存°短暂孵育。确认病毒拯救后，收集细胞上清液或羊水中的病毒，并于 -80 ℃ 保存。°C. 质粒 所有质粒均按照生产商说明，使用质粒大提试剂盒制备’s 的建议。所有质粒均分装为 1 的浓度 μg/ml 在 ddH₂O 中2O 并在 -20 保存°C. 短期保存时，质粒可置于4℃保存°C. 通过在260 nm处进行分光光度法测定纯化后的DNA质粒浓度，并利用260:280 nm比值评估其纯度。260:280 nm比值在1.8–2.0之间的样品被认为适用于病毒拯救实验。此外，应通过琼脂糖凝胶电泳确认质粒的浓度和纯度。图2展示了含有甲型流感病毒A/PR/8/34八个病毒基因的双义性pDZ质粒（6）（7）。 病毒 所述拯救流感病毒A/PR/8/34的实验方案可在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。受污染的材料，包括组织培养上清液和鸡胚，应在丢弃前进行灭菌处理。拯救其他流感病毒可能需要更高级别的生物安全条件，因此必须遵循相应的特殊条件或安全防护措施。 组织培养基与溶液 DMEM 10%FBS 1%PS：445 ml DMEM’s 改良的 Eagle’s 培养基（DMEM）、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100X 青霉素/链霉素（PS）。4℃ 保存°C. 该培养基将用于维持293T和MDCK细胞以及转染实验。DMEM 0.3%BA 1%PS：495.7 ml DMEM，4.3 ml 35% 牛血清白蛋白（BA）。4 ℃保存°C. 使用前，加入TPCK处理的胰蛋白酶，使其终浓度为1 μg/ml。感染性培养基。 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）：80 g NaCl，2 g KCl，11.5 g Na2HPO4.7H2O，2 g KH2PO4. 加入ddH₂O2加水至1升，调节pH至7.3，高压灭菌，室温保存。 1X PBS：将10X PBS用ddH₂O按1:10比例稀释2O. 高压灭菌后室温保存。 |
参考文献
- Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
- Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A.
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