使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

摘要

采用Langendorff模式的离体心脏灌流结合³¹P核磁共振波谱法，将生物化学与生理学整合于同一实验中。该方案可在连续监测心脏生理功能的同时，动态测定心肌高能磷酸化合物的含量及其转换速率。若操作正确，此技术是评估心脏能量代谢的有力手段。

摘要

生物工程小鼠模型已成为确定分子改变与心血管疾病模型之间因果关系的有力研究工具。尽管分子生物学对于识别信号通路中的关键变化至关重要，但它不能替代对功能意义的评估。生理学虽可回答功能相关问题，但将生理学与完整跳动心脏中代谢物的生化检测相结合，才能全面揭示心脏功能与能量代谢状况。多年来，本实验室一直采用离体心脏灌流联合核磁共振（NMR）波谱技术来实现这一目标。左心室功能通过Langendorff模式离体心脏灌流进行评估，而心脏能量代谢则通过执行³¹P 磁共振波谱分析灌注心脏。利用这些技术，可以在跳动的心脏中同时测量心脏功能指标以及磷酸肌酸和 ATP 的水平。此外，还可以在施加生理或病理应激因素的同时监测这些参数。例如，可采用缺血/再灌注或高负荷挑战方案。主动脉结扎或其他心脏病理模型也同样适用。无论实验方案如何变化，均可充分描述转基因小鼠模型中分子修饰对心脏功能和能量代谢的影响，从而为相关酶学及代谢通路提供新的见解。因此，³¹P 核磁共振波谱法在心血管疾病动物模型的离体灌注心脏研究中是一种重要的研究技术。

方案

1. 本实验同时使用两个独立的系统。用于采集³¹P谱的系统由Bruker 14T磁体、Avance III控制台以及配备TopSpin V2.1软件的计算机组成。用于评估心脏功能的系统则由自行搭建的心脏灌流装置与PowerLab 4/30数据采集系统连接，并配备LabChartPro 6软件用于数据分析。
2. 实验当天，配制1升Krebs-Henseleit缓冲液，配方如下：0.5 mM EDTA、5.3 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、118 mM NaCl和25 mM NaHCO₃。混合液先用5% CO₂/95% O₂气体鼓泡10–15分钟，随后加入2 mM CaCl₂。最后加入底物，即10 mM葡萄糖和0.5 mM丙酮酸。
3. 实验过程中温度调控至关重要。当心脏置于磁体内部时，使用加热循环器将温度维持在37.0–37.5°C之间，并通过光纤温度探针全程监测温度。
4. 灌注压和左心室压通过连接至数据采集系统的压力传感器进行监测，并由配套软件实时显示。实验前使用标准血压计对传感器进行校准。此外，需充分冲洗压力导管，以彻底排除所有气泡。
5. 在心脏插入探针前，使用150 mM磷酸钠标准样品（其离子强度与KH缓冲液相当）对探针进行“校准”。这有助于增强信号，并缩短心脏定位至探针后开始采集所需的时间。
6. 为防止凝血，小鼠腹腔注射200单位肝素。5分钟后，再腹腔注射戊巴比妥钠（175 mg/kg）。
7. 迅速取出心脏（保留肺和胸腺），并立即浸入冰冻KH缓冲液中使其停搏。
8. 将心脏保持在冰上，快速去除肺组织。辨认胸腺叶并轻轻剥离以暴露主动脉，随后完全切除胸腺。通过仔细清除周围组织，分离出主动脉。
9. 使用显微缝合镊子轻轻夹住主动脉两侧壁以暴露管腔。将主动脉小心套入外径为0.965 mm的聚乙烯管（PE50）制成的插管上。用微血管夹固定主动脉位置，迅速用缝线结扎固定。移除夹子后，用镊子仔细检查插管是否位于主动脉根部上方。根据需要添加额外结扎线以确保心脏位置稳固。
10. 使用镊子和显微剪刀去除多余组织。在左心耳处做一小切口。将外径为0.61 mm的聚乙烯管（PE10）小心经左心房、左心室腔并从心尖穿出，操作时轻持心脏。剪去多余导管部分。
11. 将一个未充气的注水球囊经心房插入左心室，并用胶带或缝线固定。逐渐提高蠕动泵转速，为心脏提供足够灌注流量。在心脏置入核磁共振（NMR）探针前，持续以约2 ml/min的恒定流速进行灌注。使用千分尺注射器向左心室球囊注入少量液体使其充盈，以确认左心室压力传感器正常工作。
12. 小心将心脏插入10 mm NMR样品管中。使用宽孔“旋转器”辅助引导样品管准确进入探针内的正确位置。整个装置随后用胶带牢固固定于“脐带”连接线上。
13. 将“脐带”缓慢送入磁体上部孔道，直至心脏/NMR样品管进入10 mm NMR探针的线圈内部。
14. 当心脏在探针内达到正确位置后，调节蠕动泵流量，使灌注压达到80 mmHg（需注意，此前心脏一直以约2 ml/min的恒定流速灌注）。通过启用泵控制器上的“保持”功能维持恒定灌注压。随后让心脏平衡15–20分钟。在此期间，调节左心室球囊体积，使左心室舒张末期压力达到8–10 mmHg。
15. 在平衡期间，需优化波谱仪参数，以获得最佳的磷信号。具体操作包括将射频脉冲频率设定在磷原子核共振频率处（“调谐”），并使磁场均匀化（“匀场”）。
16. 平衡期结束后，可连续采集多个³¹P核磁共振（NMR）谱。每张谱图的采集时间取决于磁体场强、样品大小以及特定实验所需的信噪比。使用14特斯拉磁体时，通过累加256次射频脉冲信号获得谱图，每次脉冲持续20 μs，翻转角为60度，脉冲间隔2.0秒。该实验约需10分钟完成。

代表性结果

通过数据采集硬件和LabChart软件，可在整个实验过程中测量心脏功能的多个参数。心脏功能的常用指标是左心室发展压（LVDevP），通过从收缩压中减去舒张末期压力（EDP）获得（图1）。该指标可能因小鼠品系和心脏状态（例如压力超负荷）而异。然而，在舒张末期压力固定为8-10 mmHg时，正常C57BL6小鼠心脏的LVDevP通常在100-110 mmHg之间。此外，LabChart程序可根据左心室压力波形的周期性变化来测量心率。这一参数也可能存在变异，当心脏以固有节律跳动时，典型值为350-400 bpm。然而，也可使用起搏系统将心率标准化为420 bpm。此外，可通过左心室压力波形的一阶导数估算心肌收缩性（+dP/dt）和舒张功能（-dP/dt）。在实验过程中，通过建立压力-容积关系，可方便地评估Starling机制。该方法通过逐步增加左心室球囊容积，并记录相应的LVDevP和EDP来实现。随后可将这些数值绘制成图，如图2所示。尽管Starling曲线最为理想，但记录达到8-10 mmHg EDP所需的容积，可间接反映左心室腔的大小。该方法可用于主动脉缩窄模型：与对照组相比，肥厚心脏通常需要较小的球囊容积，而扩张心脏则需要较大的容积。表1展示了灌注实验过程中获得的代表性心脏功能数据。

如图2所示，³¹P核磁共振波谱仪将提供磷酸肌酸（PCr）和来自ATP的三个磷酸基团（γ-ATP、α-ATP和β-ATP）以及无机磷酸盐（Pi）的信号。分析这些峰中的每一个均可得到其峰下面积的数值。ATP的含量通过取γ-ATP和β-ATP峰面积的平均值来估算（不使用α-ATP，因为NAD分子对总信号的未知部分有贡献）。心脏的能量状态由PCr与ATP峰面积的比值（PCr:ATP比值）决定。当小鼠心脏以葡萄糖为主要底物时，该值通常为1.5–1.7。尽管³¹P核磁共振不能直接测量ATP或PCr的绝对浓度，但峰面积与样品中含磷化合物的含量成正比。这些信号的数值可通过其他方法进行估算。例如，通过高效液相色谱法（HPLC）对一组心脏样本进行ATP的直接测定，可获得平均浓度，该值随后可用于校准在波谱中观察到的平均ATP峰面积。磷酸肌酸（PCr）的浓度可根据其峰面积相对于ATP峰面积的比例计算得出。此外，还可通过分析无机磷酸盐（Pi）信号相对于PCr信号的化学位移来估算pH值¹。使用不同的射频脉冲序列，还可测量肌酸激酶反应速率或ATP合成反应速率²。

表 1. 离体灌注心脏的基础心脏功能。LVDevP：左心室发展压；LVEDP：左心室舒张末期压；HR：心率；RPP：率压积；+dP/dt：左心室压力上升速率（正向dp/dt）；-dP/dt：左心室压力下降速率（负向dp/dt）；PP：灌注压；CF：冠状动脉血流。

图1. 来自 LabChart Pro 软件的典型左心室压力波形。

图 2. 来自对照组（实线）和主动脉缩窄组（虚线）小鼠的代表性Starling曲线。A) 通过左心室球囊容积增加所测定的左心室容积变化，反映左心室发展压（LVDevP）表示的收缩功能。B) 通过左心室球囊容积增加所测定的左心室容积变化，反映舒张末期压（EDP）表示的舒张功能。LVDevP：左心室发展压（收缩压减去舒张压）；EDP：舒张末期压。

图3. 离体灌注小鼠心脏的代表性³¹P NMR谱图。注意无机磷酸盐（Pi）峰相对较小。在有氧灌注条件下，若心脏除葡萄糖外还供给丙酮酸或脂肪酸，则该峰应极小。在缺血期间，此峰增大，而磷酸肌酸（PCr）峰减小。注意α-ATP峰右侧的肩峰，此为NAD分子的贡献。Pi：无机磷酸盐；PCr：磷酸肌酸；ATP：三磷酸腺苷。

讨论

³¹P 核磁共振波谱法在离体小鼠心脏Langendorff灌流系统中的应用可提供可靠且可重复的数据^{3, 4}。然而，主动脉插管和左心室气囊插入必须操作得当，以确保心脏在核磁共振管内维持稳定的心功能。此外，温度调控至关重要，以实现正常的基础心功能。获得良好且可分析的核磁共振谱图的一个重要因素是提高信噪比。这可通过确保样品的“调谐”（tuning）和“匀场”（shimming）处于最佳状态来实现。如实验方案正文所述，在插入心脏前使用标准样品有助于完成此步骤。同时，拥有足够大小的“样品”也十分有益。重量低于100 mg的心脏通常会产生较低的磷酸肌酸（PCr）和三磷酸腺苷（ATP）信号，因此需要延长采集时间以获得良好的磷谱图。

有多种方法可以修改现有方案，以获取更多关于心脏功能和能量代谢的信息。在我们的实验室中，我们使用含有混合底物的灌注液对心脏进行灌注，这些底物可包括不同组合的脂肪酸（低浓度和高浓度）、乳酸、酮体以及胰岛素。通过在灌注液中使用稳定同位素（例如，¹³C标记的底物），我们能够根据标记的乙酰辅酶A对三羧酸（TCA）循环的相对贡献，估算底物的利用情况^5-7。为此应用，我们采用¹³C核磁共振波谱法对¹³C3-和¹³C4-谷氨酸进行同位素异构体分析。该方法要求在灌注方案结束时迅速夹取心脏组织并冷冻，随后对冷冻组织进行提取。这将作为一项额外实验，因为分析过程需要使用不同的探头及独立的设置参数。其他应用还包括在灌注液中用脱氧葡萄糖替代葡萄糖，同时利用³¹P核磁共振波谱法监测2-脱氧葡萄糖磷酸在心脏中随时间积累的情况，该方法可用于测定心肌葡萄糖摄取量^{7, 8}。此外，我们的实验室还研究了在缺血/再灌注及高负荷应激条件下灌注方案中的心脏功能与能量代谢^{6, 8-10}。

总之，在离体小鼠心脏中进行³¹P核磁共振波谱分析是一项技术上具有挑战性的操作，需要使用精密设备。然而，该方法所提供的数据对于希望分析生物工程小鼠模型心脏功能与能量代谢的研究人员而言极为宝贵。在我们的实验室中，这些技术对于理解多种应激因素对心脏功能、能量代谢及整体代谢影响的机制起到了关键作用。^{1, 11, 12}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸镁	试剂	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	试剂	Sigma-Aldrich	E1644
氯化钾	试剂	Sigma-Aldrich	P4505
碳酸氢钠	试剂	Sigma-Aldrich	S6297
氯化钠	试剂	Sigma-Aldrich	S7653
二水合氯化钙	试剂	Sigma-Aldrich	C5080
D-葡萄糖	试剂	Sigma-Aldrich	G7528
丙酮酸钠	试剂	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	设备	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	设备	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	设备	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	设备	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	设备	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	设备	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	设备	ADInstruments	MLT0699
10 mm NMR 样品管	设备	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
聚乙烯导管 PE10	设备	BD Biosciences	427401
生理压力传感器	设备	ADInstruments	MLT844
聚乙烯导管 PE50	设备	BD Biosciences	427411
微量注射器	设备	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson 镊子	设备	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo 显微剪刀	设备	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix 信号调节器	设备	Neoptix, Inc.	Reflex - 1