活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

摘要

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。

摘要

为了理解活细胞感知机械力的机制，以及它们如何响应并适应其环境，研究人员开发了一种新技术，能够在亚细胞水平上以高空间和时间分辨率研究细胞行为。该技术将原子力显微镜（AFM）与全内反射荧光（TIRF）显微镜以及高速旋转盘共聚焦显微镜（FSD）相结合。这一集成系统可广泛应用于各种贴壁活细胞中的分子动态研究，实现对细胞在机械刺激下实时响应的直接光学成像。实验结果显示，在细胞顶面施加局部机械刺激后，细胞内的肌动蛋白纤维和黏着斑发生了显著重排，并引起整个细胞体内部结构的改变。这些创新性技术将为理解活细胞在机械力作用下的重构过程与动态变化提供新的信息。本文同时提供了一份详细的实验方案及一组代表性数据，展示活细胞对机械刺激的响应过程。

方案

1. 集成显微镜系统的概述

用于这些研究的显微镜系统已有详细描述¹。简而言之，该系统由一台配备全内反射荧光（TIRF）装置的倒置型Olympus IX-81显微镜（Olympus，美国森特谷，宾夕法尼亚州）与Yokogawa CSU-22扫描头（Yokogawa Electric Inc，日本）组合而成。一台Bioscope SZ型原子力显微镜（Veeco Instruments Inc，美国圣塔芭芭拉，加利福尼亚州）安装在倒置光学显微镜上方，整个系统置于一张科研级光学平台（Newport，美国尔湾，加利福尼亚州）之上。

共聚焦组件由旋转盘扫描仪、外置滤光轮及其EMCCD相机（Roper Scientific-Photometrics，Tucson，AZ）组成，通过铝制底板刚性连接，并置于用于减振的硅胶垫上。共聚焦扫描仪通过带螺纹卡环的法兰与显微镜连接，可在进行原子力显微镜（AFM）测量时将扫描仪与显微镜分离，从而避免旋转盘扫描仪的振动影响AFM测量结果。采用氩-氪离子激光器（Spectra Physics，Mountain View，CA）作为全内反射荧光（TIRF）和共聚焦成像模式的激发光源，该激光器可选择性地耦合到两根光学纤维中，分别将激光传输至TIRF附件或扫描头。系统由两台计算机控制：Slidebook软件控制光学成像，Nanoscope软件控制AFM。

2. 细胞培养

在进行机械刺激实验前24小时，应将表达靶向特定蛋白的GFP构建体的活细胞置于玻璃底细胞培养皿中。实验当天，将细胞培养基更换为不含酚红的培养基。将细胞培养皿用磁性卡环固定在原子力显微镜（AFM）载物台上。

3. 原子力显微镜探针制备与显微镜设置

将带有2微米生物素化玻璃小球的AFM探针用DPBS洗涤五次，随后与亲和素（1 mg/ml）孵育5分钟，再用DPBS洗涤五次，接着与1 mg/mL生物素化纤连蛋白孵育5分钟。最后再洗涤五次²，将探针安装至AFM扫描器上，并将保护性硅胶裙边套在探针支架周围。调节显微镜视频观察模式，使AFM探针位于视野中央。通过将激光束对准悬臂末端来校准光学杠杆系统，然后更换为适用于单细胞成像的高倍物镜。实验开始前必须测定探针的弹簧常数，该参数将使用Nanoscope软件中的热调谐法进行测量。切换至EMCCD相机以实现荧光成像。随后选择一个细胞，并使AFM探针与其表面特定位置接触。等待20分钟，以确保在AFM探针与细胞接触部位形成牢固的局灶性黏附，之后开始机械刺激程序。

4. 活细胞的机械刺激

全内反射荧光成像（TIRF成像）^3-4 将作为可视化和定量分析黏着斑的首选方法，而转盘共聚焦成像⁵将用于观察整个细胞体内的肌动蛋白细胞骨架。原子力显微镜（AFM）⁶将在液体环境中以接触模式进行成像。

在开始机械刺激程序之前，将获取细胞的全内反射荧光（TIRF）或共聚焦图像。机械刺激由功能化的原子力显微镜（AFM）探针诱导，探针将在一段时间内（1-1.5小时）每隔3-5分钟向上移动一个离散步长。细胞的响应反应将通过Nanoscope软件连续记录为一系列高度图像，图像中的每一行代表1秒的时间单位。在采集AFM数据的同时，操作人员需持续监测AFM针尖的z轴位置，以确定下一次牵拉的合适时机。

每次机械刺激后，可在 Slidebook 软件中获取细胞的 TIRF 或共聚焦图像，同时持续采集 AFM 数据。光学图像可进行离线处理，生成显示肌动蛋白细胞骨架和黏着斑重组过程的视频。此外，每幅图像还可进行定量分析，以确定细胞面积、特定蛋白区域面积，并分析细胞的整体形态。

实验结束后，将原子力显微镜探针从细胞上移开，并在 Nanoscope 软件中测量探针的灵敏度。

该实验对噪声非常敏感！实验过程中应避免任何交谈或触碰显微镜。为了最大限度减少原子力显微镜（AFM）测量中的噪声，应将转盘共聚焦系统与显微镜解耦。细胞表面与AFM探针之间形成稳定黏着斑所需的等待时间可能因所用细胞类型及探针表面包被的基质不同而有所差异。

5. 代表性结果

图1. 同一血管平滑肌细胞（VSMC）转染了actin-mRFP和vinculin-GFP，分别通过以下方式成像：（A）细胞顶面表面的原子力显微镜（AFM）；（B）细胞底面表面的全内反射荧光显微镜（TIRF）；（C）贯穿细胞体的转盘共聚焦显微镜。 共聚焦图像显示为三维图像堆栈的最大投影。AFM图像与TIRF图像或转盘共聚焦图像之间的良好重叠分别显示在（D）和（E）中。图像尺寸为64 × 50 µm。

图 2. 转染表达肌动蛋白-mRFP 的血管平滑肌细胞经原子力显微镜（AFM）机械刺激后，通过转盘共聚焦显微镜成像。 箭头指示肌动蛋白纤维的变化：(a) 聚合/增粗，(b) 解聚/消失，或 (c) 因肌动蛋白重构而聚集束化。白色虚线表示位于细胞上方的 AFM 探针尖端。图像尺寸为 91 × 91 微米。

讨论

细胞骨架^7-10和黏着斑^11-16是动态结构，会随着细胞迁移或响应机械力而组装、解聚和更新¹⁷。它们在调控细胞生长、存活和基因表达方面具有重要功能。了解它们的特定分布和动态变化，有助于更好地理解细胞如何与基质以及细胞之间进行通讯。

该新型显微镜系统可广泛应用于各种贴壁活细胞的分子动力学研究。集成显微镜能够对亚细胞水平的快速变化进行定量监测，为理解细胞在机械力作用下发生重塑的基本过程提供了一种重要的新型工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM 探针	Novascan Technologies, Inc.		2 微米硼硅酸盐微珠，0.01 N/m，生物素表面
亲和素	Sigma-Aldrich	A9275	DPBS 中 1 mg/mL
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F4759	1 mg/mL
DPBS	Invitrogen	21600-051
平滑肌细胞 Amaxa 转染试剂盒	Lonza Inc.	VPI-1004
Mattek 培养皿（玻璃底）	MatTek Corp.	P60G-1.5-30-F	无菌 60 mm Falcon 培养皿，带 1.5 号盖玻片玻璃底