通过微注射靶向递送药物、病毒载体或细胞移植物至脑深部结构

摘要

本文介绍一种制备内径为50 μm玻璃毛细管针的方法。该技术可显著减少脑组织损伤，最大限度降低药物的被动扩散，并实现对啮齿类动物脑部的精确定位给药。

摘要

向脑实质内进行微量注射是递送药物、病毒载体或细胞移植的重要操作步骤。注射针在穿刺过程中造成的脑组织损伤是一个主要问题，尤其是在小鼠脑中，不仅因为脑体积较小，有时还需进行多次注射。本文介绍一种制备内径为50 μm玻璃毛细管针的方法，可显著减少脑组织损伤，并实现对啮齿类动物脑部的精确定位。该方法可递送小体积液体（20至100 nl），降低出血风险，并最大限度减少药物在脑实质中的被动扩散。通过使用不同规格的玻璃毛细管或调整针头内径，可注射多种类型的物质和细胞。采用玻璃毛细管进行微量注射代表了注射技术的重要改进，可在小型啮齿类动物中实现深部脑区靶向递送，同时将附带损伤降至最低。 关键词：微量注射，脑实质，玻璃毛细管针，内径，药物递送，病毒载体，细胞移植，脑损伤，小鼠脑，啮齿类动物，深部脑区靶向

方案

1. 在小鼠手术前制备玻璃针：
   1. 将毛细玻璃管放入微电极拉制仪中。
   2. 加热玻璃管中部，使局部区域的玻璃软化。
   3. 沿玻璃管的纵向轴向拉伸，初始拉伸距离需足以使局部区域的玻璃管直径减小。
   4. 持续拉伸玻璃管直至其断裂，从而获得两根相同的单通道针头。
2. 将玻璃针放入微针成型仪中，以30°角对针尖进行斜面打磨。
3. 在显微镜下检查每根针头是否具有正确的内径；对于大多数亲水性药物，30–50 μm 的内径最为理想（图1）。
4. 从玻璃针最宽的一端注入矿物油。让矿物油（MSDS, Cat. M7700）通过毛细作用进入，直至达到毛细管长度约50%的位置。在推杆周围涂抹高真空润滑脂（Dow Corning, Cat. 05054-AB），以密封针的最宽端。
5. 从玻璃针最宽端插入推杆，轻柔推动矿物油，直至针尖处出现一小滴油珠。
6. 将玻璃针牢固固定在微量注射器的针 holder 中。
7. 以2.5% Avertin（2,2,2-三溴乙醇 + 叔戊醇，1:1 w/v）对小鼠进行麻醉，剂量为25–30 μL/克体重，腹腔注射。
8. 在立体定位仪上放置加热垫，以维持动物体温在37°C。
9. 使用耳杆和门齿固定器将小鼠头部固定于立体定位仪中。
10. 用0.1% 氯己定葡糖酸盐溶液清洁小鼠头部，随后用70% 乙醇擦拭，再重复一次0.1% 氯己定葡糖酸盐溶液消毒。
11. 使用#15外科刀片从小鼠耳部沿至颅骨Lambda线作皮肤切口。
12. 用棉签擦拭颅骨以使其干燥，并将皮肤移出手术区域。
13. 使用玻璃针针尖定位Bregma缝合线的顶点，在此设定注射器的初始位置（即“零”坐标）。
14. 通过移动立体定位仪的“X”和“Y”轴，确定钻孔位置。
15. 在选定坐标处小心钻孔。微型钻头及其他金属工具需预先在干式玻璃珠灭菌器（Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00）中于250°C灭菌60秒。
16. 用精细镊子小心去除最深层的骨组织，并刺破硬脑膜（可见脑脊液渗出）。
17. 确认玻璃针可顺利通过钻孔。
18. 吸取1 μL待注射药物，并滴加至一小片Parafilm上。
19. 将Parafilm放置于颅骨上。
20. 旋转微量注射器旋钮吸取药物，同时在显微镜下观察液体是否进入玻璃针内。
21. 移除Parafilm并重新设定“零”坐标。
22. 将针移动至选定坐标，下移针 holder，使玻璃针针尖轻触脑表面，并将“Z”坐标设为零。
23. 将玻璃针插入脑实质至预定深度。
24. 以约1 nl/sec的速度缓慢注射药物。
25. 当注射达到目标体积后，让药物在脑实质内扩散2分钟，随后缓慢平稳地拔出针头。
26. 缝合手术切口，将动物从立体定位仪中取出，并放入预热的笼子中，笼内铺有干净垫料以供麻醉恢复。
27. 所有动物术后均接受5 mg/kg酮咯酸（Ketorolac）皮下注射，每12小时一次，持续24小时，以提供术后镇痛。

代表性结果：

按照本方案操作，可实现精确注射，且极细的针道可最大限度减少脑组织损伤。作为该方法的代表性结果，我们将溶血磷脂酰胆碱（lysolecithin）注射至胼胝体，以诱导白质纤维束脱髓鞘，相关研究见文献1-4。为尽量减少玻璃微针造成的脑损伤，我们仅向胼胝体注射20 nl溶血磷脂酰胆碱；但如有需要，采用相同方法亦可注射高达200 nl的体积。脱髓鞘现象可通过白质纤维束中髓鞘碱性蛋白表达缺失来检测（图2）。

图1. 直径为50-μm的玻璃针。刻度上两条短刻度线之间的距离代表50-μm的长度。

图 2. 胼胝体内的溶血卵磷脂注射。脱髓鞘表现为无髓鞘碱性蛋白表达区域（虚线区）。注意玻璃针穿刺轨迹较小（箭头所示）。标尺 = 100 μm

讨论

本视频展示的方法对于将大多数药物或病毒载体递送至大脑的特定位置非常有用。该技术的主要优势包括靶点定位的可靠性、注射的精确性以及脑部损伤和通路损伤的范围较小^{1, 2, 5, 6}。一旦该技术实现标准化，靶向误差范围应控制在50 μm或更小^{1, 2}。细胞移植也可通过使用更宽的针头（直径100–150 μm^7–9）完成。因此，可将细胞高效地递送至特定病灶区域，从而最大限度减少细胞移植所引起的附带损伤。该技术包含三个关键步骤：

1. 我们始终建议在钻孔前，先用胰岛素针头轻轻划擦颅骨，以标记选定的坐标位置。
2. 迅速插入玻璃针头，快速穿透脑表面。
3. 到达最佳深度后，应将针头再深入脑实质0.1 mm，以形成一个“通道”，使药物能够自由扩散进入脑组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
毛细玻璃管	Wiretrol I	5-000-1001
微电极拉制仪	Kopf Instruments	Model 730
显微操作仪	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
矿物油	MSDS	M7700
高真空润滑脂	Dow Corning	05054-AB
麻醉剂：2.5% Avertin			2,2,2-三溴–乙醇 + 叔戊醇，1:1 w/v
加热垫	Mastex	Model 900
立体定位仪	Kopf Instruments	Model Kopf-900
手术刀片 #15	Medi-Cut
微型钻机	Ideal Micro Drill	67-1000
精细镊子	Fine Science Tools
1-μL 微量移液器	Rainin
Parafilm M.
手术显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop 配 Contraves 系统
微量注射器	Narishige International	Model MO-10