本方案利用下拉实验测定细胞内活性 RhoC GTPase 的水平。
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摘要
摘要
RhoC GTPase 与 RhoA GTPase 具有 91% 的同源性。由于 RhoA GTPase 在细胞中广泛存在，目前已开发出多种针对 RhoA GTPase 的试剂和技术。然而，RhoC GTPase 在转移性癌细胞中的表达水平相对较低，因此针对 RhoC 的特异性试剂较少。我们已对 Rho 活化检测方法进行了改进，以用于检测 RhoC GTPase。该技术利用 GST-Rho 结合结构域融合蛋白来沉淀活化的 RhoC GTPase。此外，我们可在实验开始时收集总蛋白，以测定细胞中总 RhoC GTPase（结合 GTP 和 GDP 的形式）的水平。这使得能够确定细胞中活化态与总 RhoC GTPase 的比例。尽管已有多个该实验的商业化版本，但这些商业试剂盒主要针对 RhoA GTPase 优化，通常对 RhoC GTPase 的检测效果不佳。因此，我们对实验的部分步骤进行了优化，并开发了 RhoC 特异性抗体。
方案
1. 准备GST融合蛋白
- 制备含有 rhotekin Rho 结合域（RBD）N 端前 90 个氨基酸的 JM109 感受态细菌甘油菌株，该片段已亚克隆至 BamH1/EcoR1 位点的 pGEX3x 载体中。
为确保高效率，每次实验都必须执行以下步骤。根据我们的经验，新鲜制备的 GST-RBD 是获得稳定且准确的 GTP 酶活化检测结果的关键。 - 取约 50 μL 甘油菌（无需解冻）加入 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37°C 摇床过夜培养。
- 按 1:10 比例转接到 500 mL LB-amp 培养基中，培养 1 小时。
- 加入 0.1 mM IPTG 诱导 GST 融合蛋白表达，持续 2 小时。
- 将菌液均匀分装至离心管中，使用 Sorval GSA3 转子在 4°C、5000 RPM 条件下离心 20 分钟。
- 用 10 mL 裂解缓冲液*重悬沉淀。
*细菌裂解缓冲液：20% 蔗糖，10% 甘油，50 mM Tris（pH 8.0），0.2 mM Na2S2O5，2 mM MgCl2，2 mM DTT，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。 - 超声处理 2–3 分钟（具体时间取决于超声仪型号；我们....
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讨论
该实验流程中最关键的步骤是新鲜GST-RBD的制备。未能充分重视此步骤是实验失败的主要原因。从GST-RBD的制备（1.2）到与细胞裂解液的过夜孵育（2.5），所有步骤应在同一天内完成。另一个关键步骤是确保有足够的细胞用于制备细胞裂解液。这一点在检测RhoC GTP酶时尤为重要，因为RhoC在细胞中的表达水平通常较低。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
美国国防部 W81XWH-05-1-0005、W81XWH-06-1-0495、W81XWH-08-1-0029 和 W81XWH-08-1-0356
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 谷胱甘肽-Sepharose 4B 微珠 | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl 凝胶 | Bio-Rad | 345-0032 |
参考文献
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
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