RhoC GTP酶激活实验

摘要

本方案利用下拉实验测定细胞内活性 RhoC GTPase 的水平。

摘要

RhoC GTPase 与 RhoA GTPase 具有 91% 的同源性。由于 RhoA GTPase 在细胞中广泛存在，目前已开发出多种针对 RhoA GTPase 的试剂和技术。然而，RhoC GTPase 在转移性癌细胞中的表达水平相对较低，因此针对 RhoC 的特异性试剂较少。我们已对 Rho 活化检测方法进行了改进，以用于检测 RhoC GTPase。该技术利用 GST-Rho 结合结构域融合蛋白来沉淀活化的 RhoC GTPase。此外，我们可在实验开始时收集总蛋白，以测定细胞中总 RhoC GTPase（结合 GTP 和 GDP 的形式）的水平。这使得能够确定细胞中活化态与总 RhoC GTPase 的比例。尽管已有多个该实验的商业化版本，但这些商业试剂盒主要针对 RhoA GTPase 优化，通常对 RhoC GTPase 的检测效果不佳。因此，我们对实验的部分步骤进行了优化，并开发了 RhoC 特异性抗体。

方案

1. 准备GST融合蛋白

1. 制备含有 rhotekin Rho 结合域（RBD）N 端前 90 个氨基酸的 JM109 感受态细菌甘油菌株，该片段已亚克隆至 BamH1/EcoR1 位点的 pGEX3x 载体中。
   
   为确保高效率，每次实验都必须严格执行以下步骤。根据我们的经验，新鲜制备的 GST-RBD 是获得稳定且准确的 GTP 酶活化检测结果的关键。
2. 取约 50 μL 甘油菌（无需解冻）加入 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37°C 摇床过夜培养。
3. 按 1:10 比例转接到 500 mL LB-amp 培养基中，培养 1 小时。
4. 加入 0.1 mM IPTG 诱导 GST 融合蛋白表达，持续 2 小时。
5. 将菌液均匀分装至离心管中，使用 Sorval GSA3 转子在 4°C、5000 RPM 条件下离心 20 分钟。
6. 用 10 mL 裂解缓冲液*重悬沉淀。
   *细菌裂解缓冲液：20% 蔗糖，10% 甘油，50 mM Tris（pH 8.0），0.2 mM Na₂S₂O₅，2 mM MgCl₂，2 mM DTT，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。
7. 超声处理 2–3 分钟（具体时间取决于超声仪型号；....

讨论

该实验流程中最关键的步骤是新鲜GST-RBD的制备。未能充分重视此步骤是实验失败的主要原因。从GST-RBD的制备（1.2）到与细胞裂解液的过夜孵育（2.5），所有步骤应在同一天内完成。另一个关键步骤是确保有足够的细胞用于制备细胞裂解液。这一点在检测RhoC GTP酶时尤为重要，因为RhoC在细胞中的表达水平通常较低。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
谷胱甘肽-Sepharose 4B 微珠	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl 凝胶	Bio-Rad	345-0032