本方案利用下拉实验测定细胞内活性 RhoC GTPase 的水平。
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摘要
摘要
RhoC GTPase 与 RhoA GTPase 具有 91% 的同源性。由于 RhoA GTPase 在细胞中广泛存在，目前已开发出多种针对 RhoA GTPase 的试剂和技术。然而，RhoC GTPase 在转移性癌细胞中的表达水平相对较低，因此针对 RhoC 的特异性试剂较少。我们已对 Rho 活化检测方法进行了改进，以用于检测 RhoC GTPase。该技术利用 GST-Rho 结合结构域融合蛋白来沉淀活化的 RhoC GTPase。此外，我们可在实验开始时收集总蛋白，以测定细胞中总 RhoC GTPase（结合 GTP 和 GDP 的形式）的水平。这使得能够确定细胞中活化态与总 RhoC GTPase 的比例。尽管已有多个该实验的商业化版本，但这些商业试剂盒主要针对 RhoA GTPase 优化，通常对 RhoC GTPase 的检测效果不佳。因此，我们对实验的部分步骤进行了优化，并开发了 RhoC 特异性抗体。
方案
1. 准备GST融合蛋白
- 制备含有 rhotekin Rho 结合域（RBD）N 端前 90 个氨基酸的 JM109 感受态细菌甘油菌株，该片段已亚克隆至 BamH1/EcoR1 位点的 pGEX3x 载体中。
为确保高效率，每次实验都必须执行以下步骤。根据我们的经验，新鲜制备的 GST-RBD 是获得稳定且准确的 GTP 酶活化检测结果的关键。 - 取约 50 μL 甘油菌（无需解冻）加入 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37°C 摇床过夜培养。
- 按 1:10 比例转接到 500 mL LB-amp 培养基中，培养 1 小时。
- 加入 0.1 mM IPTG 诱导 GST 融合蛋白表达，持续 2 小时。
- 将菌液均匀分装至离心管中，使用 Sorval GSA3 转子在 4°C、5000 RPM 条件下离心 20 分钟。
- 用 10 mL 裂解缓冲液*重悬沉淀。
*细菌裂解缓冲液：20% 蔗糖，10% 甘油，50 mM Tris（pH 8.0），0.2 mM Na2S2O5，2 mM MgCl2，2 mM DTT，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。 - 超声处理 2–3 分钟（具体时间取决于超声仪型号；我们使用 Fischer Sonic Dismembranator Model 500，设置为档位 6，占空比 50%）。
- 使用 Sorvall SS34 转子在 4°C、10,000 rpm 条件下离心 20 分钟。此时可取少量上清进行 SDS-PAGE 分析，考马斯亮蓝染色后应可见约 46 kDa 处的蛋白条带。
- 弃去上清，加入 1 mL 50% 谷胱甘肽-Sepharose 4B 悬浮液。
- 4°C 旋转孵育 30 分钟，用裂解缓冲液洗涤 3 次。
- 用 GST-fish 缓冲液**将 GST-RBD/谷胱甘肽-Sepharose 微珠重悬为约 1 mL 的 50% 悬浮液。**GST-Fish 缓冲液：10% 甘油，50 mM Tris（pH 7.4），100 mM NaCl，1% NP-40，2 mM MgCl2，临用前新鲜添加 PMSF、苯甲酰胺、抑肽酶和亮抑酶肽。
2. GST融合蛋白下拉实验
- 每次实验使用 5-10 × 106 个细胞
- 用预冷的 PBS 洗涤细胞一次，将培养板置于冰上（我们使用装满冰的平底玻璃皿），并加入 0.5 mL GST-fish 缓冲液进行裂解。
- 冰上孵育 5 分钟，用橡胶刮棒或平头刮刀收集细胞，转移至微量离心管中，在 4°C 下以 20,000 r.p.m. 离心 5 分钟。
- 将上清液转移至新的微量离心管中。取 50 μL 用于测定总 Rho 蛋白量（即结合 GDP 和 GTP 的 Rho 总量）。
- 加入 0.5 mL GST-RBD/谷胱甘肽-Sepharose 珠子，在 4°C 下旋转孵育过夜。
- 用 GST-fish 缓冲液洗涤 6 次。
- 将珠子重悬于 40 μL 2× Laemmli 样品缓冲液中。
此时应测定步骤 2.4 中取样的总 Rho 蛋白浓度，并准备 30 μg 样品，与相应的激活样品一同上样电泳。 - 样品在 90°C 下煮沸 5 分钟，短暂离心后取上清液（避免珠子），上样并使用 12 孔 4–20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶进行电泳。
- 电泳电压不超过 150 伏，使用 Towbin 缓冲液并以恒定功率 100 W 将蛋白转移至膜上。
- 用 5% 脱脂牛奶/TBST 溶液封闭膜，然后用 RhoC 特异性抗体进行杂交检测。
3. 代表性结果
理想结果应在约 22 kDa 处出现单一条带。结果不佳时会出现多条条带或高背景信号，这表明可能存在蛋白质降解、样品洗涤不充分或使用了陈旧的 GST-RBD。
图 1. 三种表达不同水平 RhoC GTPase 的独立细胞系用于展示 RhoC 活性形式和总蛋白的低表达、高表达或无表达情况。随后将印迹膜剥离并用针对持家基因肌动蛋白（actin）的抗体重新杂交，作为总 RhoC 蛋白的上样对照。
图 2. 多重条带或高背景信号可能源于蛋白质降解、样品洗涤不充分或使用了陈旧的 GST-RBD。
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讨论
该实验流程中最关键的步骤是新鲜GST-RBD的制备。未能充分重视此步骤是实验失败的主要原因。从GST-RBD的制备（1.2）到与细胞裂解液的过夜孵育（2.5），所有步骤应在同一天内完成。另一个关键步骤是确保有足够的细胞用于制备细胞裂解液。这一点在检测RhoC GTP酶时尤为重要，因为RhoC在细胞中的表达水平通常较低。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
美国国防部 W81XWH-05-1-0005、W81XWH-06-1-0495、W81XWH-08-1-0029 和 W81XWH-08-1-0356
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 谷胱甘肽-Sepharose 4B 微珠 | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl 凝胶 | Bio-Rad | 345-0032 |
参考文献
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- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
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