通过将底物L-赖氨酸和产物尸胺与2,4,6-三硝基苯磺酸反应生成在甲苯中溶解度不同的加合物，来监测可诱导赖氨酸脱羧酶的活性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Escherichia coli 是一种肠道细菌，能够在较宽的 pH 范围（pH 5 - 9）1内生长，且令人惊讶的是，它还能在极端酸性胁迫下存活，包括通过哺乳动物胃部时，其中 pH 可低至 pH 1 - 22。为适应如此广泛的酸性 pH 环境，E. coli 拥有四种可诱导的氨基酸脱羧酶，这些酶以依赖质子的方式对其底物氨基酸进行脱羧，从而提高细胞内 pH。这些脱羧酶包括谷氨酸脱羧酶 GadA 和 GadB3、精氨酸脱羧酶 AdiA4、赖氨酸脱羧酶 LdcI5, 6 以及鸟氨酸脱羧酶 SpeF7。所有这些酶均以磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）作为辅因子8，并与内膜上的底物-产物反向转运蛋白协同作用，将脱羧产物转运至胞外，同时交换新的底物进入细胞2。对于 LdcI 而言，其赖氨酸-尸胺反向转运蛋白为 CadB。近期，我们解析了 LdcI 的 X 射线晶体结构，分辨率达到 2.0 Å，并发现一种新型小分子结合于 LdcI —— 严格反应调控因子鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）14。严格反应通常发生在指数生长期的细胞遭遇营养缺乏或其他多种胁迫时9。此时，细胞会生成 ppGpp，进而触发信号级联反应，最终促使细胞由指数生长期转入静止期10。我们已证实 ppGpp 是 LdcI 的特异性抑制剂14。本文中，我们描述了一种赖氨酸脱羧酶活性检测方法，该方法经 Phan 等人开发的检测法改良而来11，用于测定 LdcI 的酶活性以及 pppGpp/ppGpp 对其活性的影响。LdcI 催化的脱羧反应可去除 L-赖氨酸的 α-羧基，生成二氧化碳和多胺类物质尸胺（1,5-二氨基戊烷）5。L-赖氨酸与尸胺可在高 pH 条件下与 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）反应，分别生成 N,N'-双三硝基苯基尸胺（TNP-尸胺）和 N,N′-双三硝基苯基赖氨酸（TNP-赖氨酸）11。TNP-尸胺可与 TNP-赖氨酸分离，因为前者可溶于甲苯等有机溶剂，而后者则不溶（见图1）。本检测方法的线性范围通过使用纯化的尸胺进行实验测定。
方案
1）试剂与设备
- 首先，配制以下三种溶液：1 mL 溶液A，由8 mM L-赖氨酸、100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.2 mM 核苷酸（核苷酸为二磷酸鸟苷（GDP）、三磷酸鸟苷（GTP）、鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）或鸟苷-5'-三磷酸-3'-二磷酸（pppGpp）中的一种）、0.1 mM 5'-磷酸吡哆醛（PLP）和1 mM β-巯基乙醇（β-ME）组成；1 mL 溶液B，由100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.1 mM PLP、1 mM β-ME 和 50 nM LdcI 组成。LdcI 的纯化方法见 Snider 的描述 等.6 和 Kanjee 等. 14.
1 mL 溶液C，该溶液与溶液B相同，但不含LdcI。 - 配制 100 mL 终止液，其中含 1 M 碳酸钠（10.6 g/100 mL），并分装 50 μL 使用多通道移液器向96孔聚苯乙烯板的每个孔中加入 30 μL 向孔板中加入水，然后盖上盖子。注意，所加水的体积与酶反应过程中提取的样品体积之和必须相等 50 μL。在这种情况下， 20 μL 将移除酶反应样品。
- 通过稀释配制 5 mL 浓度为 10 mM 的 TNBS 溶液 294 μL 5% (w/v) TNBS 储存液 4706 μL 水，用铝箔纸包裹并置于冰上保存。
- 将 Eppendorf ThermoStat Plus 平衡至 37°CThermoStat Plus 具有 6 列共 24 个孔。示意图见图 2。标记 1.5 mL Eppendorf 管，标明将要测试的核苷酸种类（每列一个）：GTP（A 列）、GDP（B 列）、ppGpp（C 列）、pppGpp（D 列）、无核苷酸（E 列）和蛋白样品（F 列）。
- 架起数个盒子 200 μL 移除部分枪头，使每间隔一行移除一行，最终保留四行枪头。此步骤对于在酶活性检测中将多通道移液器与ThermoStat Plus加热模块配合使用是必要的。
- 将数字加热块（VWR）平衡至 42°C.
- 将一个96孔2.0 mL聚丙烯板置于冰上冷却。
2) LdcI 检测
- 使用适当的核苷酸，将溶液A各50 μL分装至Eppendorf ThermoStat的五个列中的1.5 mL Eppendorf管中。
- 向F列中的三个管中各加入330 μL溶液B，并向F列最后一个管中加入330 μL溶液C（无蛋白对照）。
- 将溶液在37°C下平衡5分钟。提示：5分钟后，剪掉加热块中央各管的管盖，以避免其干扰下一步使用的多通道移液器。
- 使用5–50 μL VWR多通道移液器，将F列各管中的50 μL转移至A–E列的每个管中。从第一个管混合开始时即启动计时器。
- 在2、4和6分钟时，使用多通道移液器取出20 μL样品，加入终止液中。
- 注意：终止液中的样品可用塑料膜覆盖，并在-20°C下冷冻以备后续处理。在与TNBS反应前，应将板在室温下解冻。
3）TNBS 反应与显色
- 使用多通道移液器向终止液中加入 50 μL 的 10 mM TNBS 溶液，然后在 42°C 下孵育 6 分钟。随着 TNBS 与赖氨酸和尸胺发生反应，溶液将变为深黄色/橙色。
- 6 分钟后，将酶标板置于冰上冷却以减缓反应速度。
- 使用 VWR 20–200 μL 多通道移液器吸取 100 μL 样品，转移至预先在冰上冷却的 2 mL 深孔板中。将装有冰的冰桶转移至通风橱内。
- 使用 HandyStep（Brand）多排移液器和 12.5 mL 移液器吸头（Plastibrand），向每个孔中加入 500 μL 甲苯。
- 用无尘纸擦去多余的甲苯，并用包装胶带密封酶标板。确保用力按压以形成良好密封。用平盖盖住 96 孔板，剧烈振荡 1 分钟 30 秒。
- 让溶液静置 5 分钟。此时 TNP-尸胺位于上层甲苯相中，而 TNP-赖氨酸仍溶于水相（见图 1）。
- 使用 20–200 μL 多通道移液器吸取 200 μL 甲苯层至用于检测的 96 孔板中。注意：务必检查所取每份样品是否澄清，避免混入底层水相。注意：使用带滤芯吸头，以防止甲苯对多通道移液器造成损害。
- 在 SpectraMax 340 酶标仪中于 340 nm 处读取吸光度。
- 清洗石英板时，先用水冲洗去除甲苯，然后将石英板放入通风橱内的大玻璃托盘中。倒入 100 mL 7:3 的 70%（v/v）硝酸与 95%（v/v）乙醇混合液，并用另一玻璃托盘盖住石英板。警告：该反应剧烈放热，有时可能发生爆炸，请穿戴适当的防护装备，并确保通风橱窗高度设置在最低 6 英寸位置。待冷却后，用水冲洗去除硝酸，再用 95% 乙醇清洗。
4）代表性结果
1）尸胺标准曲线（图3）
实验操作如前所述，但不添加L-赖氨酸或LdcI，而是使用不同浓度的尸胺，以经验性确定实验的线性范围。该实验的线性范围可达OD340为0.25，相当于约22 nmol的尸胺（图3）。
2）LdcI 的活性（图 4）
单独 LdcI 的活性在 pH 6.5 条件下测定为 153.5 (± 18.1) nmoles 鲸尸胺 min⁻¹ μg LdcI⁻¹。LdcI 的活性在存在 100 μM GTP 或 GDP 时不受影响，但在存在 pppGpp 和 ppGpp 时受到强烈抑制（>10 倍）（图 4）。
图1. LdcI反应的示意图。 图示L-赖氨酸脱羧生成CO2和尸胺的反应，以及在高pH条件下与TNBS进一步反应生成N,N'-双三硝基苯基尸胺（TNP-尸胺）和N,N'-双三硝基苯基赖氨酸（TNP-赖氨酸）。依据Phan等人的研究11
图 2. Eppendorf恒温仪的设置。 图示为24孔Eppendorf ThermoStat中样品的排布，并附有检测各步骤的说明（以粗体标出）。箭头表示根据实验方案转移反应液的过程。同时标出了将反应液转移至96孔板中终止液的操作。
图3. 尸胺标准曲线。 图中显示了在340 nm处的吸光度与尸胺（nmol）之间的关系。误差线代表至少三次独立测量的标准偏差。图中还显示了最佳拟合直线，其R²为0.996。
图 4. LdcI 酶活性测定结果。 图示 LdcI 活性速率（单位：nmol 尸胺 min⁻¹ μg⁻¹ LdcI）在 100 μM GTP、GDP、pppGpp、ppGpp 存在下以及无核苷酸条件下的变化。严谨反应核苷酸 (p)ppGpp 能够显著抑制 LdcI 的活性。误差线代表至少六次独立测量的标准偏差。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在赖氨酸脱羧酶检测中，TNBS 与 L-赖氨酸和尸胺中的伯胺反应，生成 TNP-赖氨酸和 TNP-尸胺加合物（图1）。由于 TNP-赖氨酸含有羧基，该加合物可溶于水；而 TNP-尸胺缺乏羧基，因此能够分配进入甲苯相11。此类检测方法也可更广泛地应用于其他类型的氨基酸反应，特别是反应过程中发生羧基丢失的情况。例如，可诱导的鸟氨酸脱羧酶 SpeF 催化 L-鸟氨酸脱羧生成多胺腐胺7，以及可诱导的精氨酸脱羧酶 AdiA 催化 L-精氨酸脱羧生成多胺氨丁胺4，均属于此类反应。
本文所述的LdcI检测方法为体外测定纯化蛋白活性提供了一种相对较快的方法。该检测方法的主要优势包括：
i) 每次实验使用多个重复样本可提高每次测量的精确度；
ii) 该检测可在多种缓冲条件（不同pH值、盐浓度、还原剂等）下进行，无需修改实验方案；
iii) 该检测方法可进行修改以...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的迈克尔·卡谢尔博士（Dr. Michael Cashel）向我们提供细菌菌株、质粒及必要的实验方案。我们感谢多伦多大学生物化学系的约翰·格洛弗博士（Dr. John Glover）提供SpectraMax酶标仪的使用。UK获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金、加拿大卫生研究院疾病相关膜蛋白结构生物学战略培训项目以及多伦多大学开放博士后奖学金的资助。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-67210）向WAH提供的基金资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-三硝基苯磺酸 | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM 吡哆醛 5’-磷酸盐 (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| 尸胺 | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96孔聚苯乙烯板 | Sarstedt Ltd | ||
| 96孔石英板 | Hellma | ||
| VWR 数字加热块 | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96孔聚丙烯板 | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step 重复移液器 | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL 重复移液器吸头 | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC 酶标仪 | SpectraMax |
参考文献
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
