通过将底物L-赖氨酸和产物尸胺与2,4,6-三硝基苯磺酸反应生成在甲苯中溶解度不同的加合物，来监测可诱导赖氨酸脱羧酶的活性。
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摘要
摘要
Escherichia coli 是一种肠道细菌，能够在较宽的 pH 范围（pH 5 - 9）1内生长，且令人惊讶的是，它还能在极端酸性胁迫下存活，包括通过哺乳动物胃部时，其中 pH 可低至 pH 1 - 22。为适应如此广泛的酸性 pH 环境，E. coli 拥有四种可诱导的氨基酸脱羧酶，这些酶以依赖质子的方式对其底物氨基酸进行脱羧，从而提高细胞内 pH。这些脱羧酶包括谷氨酸脱羧酶 GadA 和 GadB3、精氨酸脱羧酶 AdiA4、赖氨酸脱羧酶 LdcI5, 6 以及鸟氨酸脱羧酶 SpeF7。所有这些酶均以磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）作为辅因子8，并与内膜上的底物-产物反向转运蛋白协同作用，将脱羧产物转运至胞外，同时交换新的底物进入细胞2。对于 LdcI 而言，其赖氨酸-尸胺反向转运蛋白为 CadB。近期，我们解析了 LdcI 的 X 射线晶体结构，分辨率达到 2.0 Å，并发现一种新型小分子结合于 LdcI —— 严格反应调控因子鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）14。严格反应通常发生在指数生长期的细胞遭遇营养缺乏或其他多种胁迫时9。此时，细胞会生成 ppGpp，进而触发信号级联反应，最终促使细胞由指数生长期转入静止期10。我们已证实 ppGpp 是 LdcI 的特异性抑制剂14。本文中，我们描述了一种赖氨酸脱羧酶活性检测方法，该方法经 Phan 等人开发的检测法改良而来11，用于测定 LdcI 的酶活性以及 pppGpp/ppGpp 对其活性的影响。LdcI 催化的脱羧反应可去除 L-赖氨酸的 α-羧基，生成二氧化碳和多胺类物质尸胺（1,5-二氨基戊烷）5。L-赖氨酸与尸胺可在高 pH 条件下与 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）反应，分别生成 N,N'-双三硝基苯基尸胺（TNP-尸胺）和 N,N′-双三硝基苯基赖氨酸（TNP-赖氨酸）11。TNP-尸胺可与 TNP-赖氨酸分离，因为前者可溶于甲苯等有机溶剂，而后者则不溶（见图1）。本检测方法的线性范围通过使用纯化的尸胺进行实验测定。
方案
1）试剂与设备
- 首先，配制以下三种溶液：1 mL 溶液A，由8 mM L-赖氨酸、100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.2 mM 核苷酸（核苷酸为二磷酸鸟苷（GDP）、三磷酸鸟苷（GTP）、鸟苷-5'-二磷酸-3'-二磷酸（ppGpp）或鸟苷-5'-三磷酸-3'-二磷酸（pppGpp）中的一种）、0.1 mM 5'-磷酸吡哆醛（PLP）和1 mM β-巯基乙醇（β-ME）组成；1 mL 溶液B，由100 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠（MES）pH 6.5、0.1 mM PLP、1 mM β-ME 和 50 nM LdcI 组成。LdcI 的纯化方法见 Snider 的描述 等.6 和 Kanjee 等. 14.
1 mL 溶液C，该溶液与溶液B相同，但不含LdcI。 - 配制 100 mL 终止液，其中含 1 M 碳酸钠（10.6 g/100 mL），并分装 50 μL 使用多通道移液器向96孔聚苯乙烯板的每个孔中加入 30 μL 向孔板中加入水，然后盖上盖子。注意，所加水的体积与酶反应过程中提取的样品体积之和必须相等 50 μL。在这种情况下， 20 μL 将移除酶反应样品。
- 通过稀释配制 5 mL 浓度为 10 mM 的 TNBS 溶液 294 μL 5% (w/v) TNBS 储存液 4706 μL 水....
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讨论
在赖氨酸脱羧酶检测中，TNBS 与 L-赖氨酸和尸胺中的伯胺反应，生成 TNP-赖氨酸和 TNP-尸胺加合物（图1）。由于 TNP-赖氨酸含有羧基，该加合物可溶于水；而 TNP-尸胺缺乏羧基，因此能够分配进入甲苯相11。此类检测方法也可更广泛地应用于其他类型的氨基酸反应，特别是反应过程中发生羧基丢失的情况。例如，可诱导的鸟氨酸脱羧酶 SpeF 催化 L-鸟氨酸脱羧生成多胺腐胺7，以及可诱导的精氨酸脱羧酶 AdiA 催化 L-精氨酸脱羧生成多胺氨丁胺4，均属于此类反应。
本文所述的LdcI检测方法为体外测定纯化蛋白活性提供了一种相对较快的方法。该检测方法的主要优势包括：
i) 每次实验使用多个重复样本可提高每次测量的精确度；
ii) 该检测可在多种缓冲条件（不同pH值、盐浓度、还原剂等）下进行，无需修改实验方案；
iii) 该检测方法可进行修改以.......
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致谢
我们感谢美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的迈克尔·卡谢尔博士（Dr. Michael Cashel）向我们提供细菌菌株、质粒及必要的实验方案。我们感谢多伦多大学生物化学系的约翰·格洛弗博士（Dr. John Glover）提供SpectraMax酶标仪的使用。UK获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金、加拿大卫生研究院疾病相关膜蛋白结构生物学战略培训项目以及多伦多大学开放博士后奖学金的资助。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-67210）向WAH提供的基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-三硝基苯磺酸 | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM 吡哆醛 5’-磷酸盐 (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| 尸胺 | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96孔聚苯乙烯板 | Sarstedt Ltd | ||
| 96孔石英板 | Hellma | ||
| VWR 数字加热块 | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96孔聚丙烯板 | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step 重复移液器 | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL 重复移液器吸头 | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC 酶标仪 | SpectraMax |
参考文献
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W.
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