开发了一种双模成像系统，用于无接触评估皮肤组织氧合和血管功能。
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摘要
摘要
准确评估皮肤组织氧合状态和血管功能对于多种健康障碍（如慢性伤口）的恰当检测、分期和治疗至关重要。我们报道了一种双模态成像系统的开发，用于无创、非接触式地成像皮肤组织氧合状态和血管功能。该成像系统集成了红外相机、CCD相机、液晶可调滤光片和高强度光纤光源。采用Labview编程构建了用于设备控制、同步、图像采集、处理和可视化的人机界面。CCD相机采集的多光谱图像用于重建组织氧合图。红外相机采集的动态热成像图像用于重建血管功能图。通过基准标记实现皮肤组织氧合图像与血管功能图像的共配准。该双模态成像系统的性能特征已在人体中进行了测试。
方案
1. 通过多光谱成像绘制组织氧合图
一种综合性伤口中心（CWC）双模成像系统，以下简称CWC系统，由俄亥俄州立大学开发，用于皮肤组织氧合的多光谱成像和血管功能的热成像。采用宽间隔二阶导数光谱技术，基于多光谱图像重建组织氧合图谱1。在本研究中，一名健康受试者就座，左前臂置于台面上。将前臂位于CWC系统视野范围内的一部分区域涂抹印度墨水（1%溶于乙醇）以模拟不同肤色。采集多光谱图像，并基于宽间隔二阶导数光谱重建氧合图谱。将重建所得的氧合图谱与商用Hypermed OxyVu高光谱组织氧合测量系统获取的结果进行比较。
采用闭塞后反应性充血（PORH）方案2，在同一受试者身上研究了组织对血管闭塞的氧响应。在进行PORH测试前，使用绑于左上臂的血压袖带记录受试者的收缩压和舒张压。PORH方案包括：2分钟的闭塞前基线期、2分钟的超收缩压闭塞期（收缩压+50 mm Hg）以及2分钟的反应性充血期。在PORH测试期间，以每波长0.75秒的采样速率，在四个波长（即530 nm、550 nm、570 nm和590 nm）下采集多光谱图像。深层组织氧饱和度和皮肤组织氧张力分别通过OxiplexTS组织分光光度计（ISS Inc.，Urbana Champaign，IL）和TCM经皮氧监测仪（Radiometer，Denmark）在同一手臂上同步记录。
2. 通过动态热成像技术绘制血管功能图谱
采用相同的CWC系统，在一名健康受试者身上进行了动态热成像实验。受试者以仰卧位舒适地平躺在检查台上，左臂置于台面上，左手背朝上，正对CWC系统的红外相机单元。在同一手的手指尖放置一个激光多普勒探头，用于持续监测指端皮肤灌注情况。在左上臂放置一个加压袖带，以产生不同程度的血流阻断。实验开始前，要求受试者静息至少10分钟，并通过加压袖带记录其收缩压和舒张压。动态热成像图像在以下袖带压力水平下采集：无阻断、0.5倍舒张压、0.5倍（舒张压+收缩压）以及1.5倍收缩压。在每个压力水平下，通过将一个室温（25°C）的水袋放置于左手30秒，施加热刺激。热刺激移除后，立即以每秒2帧的速率采集左手的热成像图像，同时激光多普勒探头以10 Hz的采样频率记录指尖皮肤灌注情况。每次测试之间的间隔时间为10分钟。事先标记左手的位置，以确保后续测量位置一致。通过计算温度响应和血管功能指数来评估不同阻断水平下的组织血管功能。血管功能指数定义为热刺激后时间的平方根与相应温度变化的比值。
3. 组织氧合与血管功能图谱之间的共定位
通过动态热成像获取的皮肤组织血管功能图与通过多光谱成像获取的皮肤组织氧合图，由一种先进的成像算法进行共配准。在生物组织上放置了四个具有同时热学和光学对比度的基准标记物，以辅助图像共配准。目前，将光学图像（及氧合图）与热图像（及血管功能图）共配准的实验方案包括以下关键步骤：1）将所有图像转换为灰度图像，并将像素强度值归一化至0到1之间；2）对于光学照片，识别出像素强度值高于经验性全局阈值的前景区域（即皮肤区域，该阈值为整幅图像平均强度值的0.8倍）；使用形态学闭运算填充前景区域中的小孔洞；3）将前景中强度值低于全局阈值以及自适应局部阈值的较暗区域识别为基准标记区域，其中自适应局部阈值由20×20像素邻域内的平均像素值定义，该方法可适应光照变化；4）使用形态学操作进一步优化基准标记区域，以去除噪声和尖峰；选取四个区域的质心作为光学照片中的控制点；5）采用类似步骤在热图像中识别标记区域；6）基于空间邻近性匹配两组控制点（因两台相机位置相近）；7）以热图像为参考，计算两幅图像之间的仿射变换，并相应地变换光学照片及氧合图（该图由与光学照片相同的相机获得）；8）最终生成叠加图像用于可视化。
4. 代表性结果：
氧合方案（即方案 #1）的代表性结果是基于宽间隔二阶导数光谱法重建的皮肤组织氧合图。宽间隔二阶导数光谱法有效降低了由组织背景吸收引起的测量伪影，从而使皮肤氧合测量受模拟皮肤颜色变化的影响减小。我们还展示了一种反应性充血（PORH）方案，其中同时记录了皮肤组织氧合图、深层组织氧合以及皮肤组织氧张力。
血管功能实验方案（即方案 #2）的代表性结果包括皮肤组织的温度分布、皮肤组织对外部热刺激的温度变化，以及通过动态热成像获得的皮肤组织血管指数图。观察到皮肤组织血管指数的热成像结果与激光多普勒法测量的皮肤组织灌注量之间存在相关性。
共配准方案（即方案 #3）的代表性结果包括组织氧合图、血管指数图，以及通过多对比度基准标记物共配准的摄影图像、氧合图像和血管指数图像的融合图像。
图1. 用于组织氧合与血管功能无接触成像的CWC双模式系统装置。 该系统安装在移动推车上，由红外热成像相机、CCD相机、液晶可调滤光片和宽带光源组成。通过计算机同步完成数据采集、分析和显示任务。
图2. CWC系统的软件界面。 软件界面在Labview环境中编程实现。界面上方左侧为硬件配置和系统校准的控制面板。界面右侧为红外相机采集的组织温度图的实时显示。界面底部为皮肤组织灌注的激光多普勒测量结果。
图3. CWC系统软件界面（续）。 此为显示组织氧合参数的弹出窗口。左侧为根据多光谱图像重建的组织氧合图。界面右侧自上而下显示以下组织氧合参数：（1）从组织氧合图中选定的兴趣区域（ROI）计算得到的皮肤组织氧合平均值；（2）由OxplexTS组织氧仪监测的深层组织氧合；（3）由TCM经皮氧监测仪监测的皮肤组织氧张力。
图4. 采用OxyVu成像系统进行皮肤组织氧合成像。 左侧图像为皮肤组织的灰度图像。在皮肤表面涂覆一层墨水以模拟皮肤颜色。右侧为OxyVu系统获取的皮肤组织氧合图。分别在墨水涂覆区域内部和外部选取了两个方形感兴趣区域（ROIs）。在墨水涂覆区域内，皮肤组织平均氧合水平为62.8±11.0%；在墨水涂覆区域外，皮肤组织平均氧合水平为44.0±11.0%。墨水涂覆皮肤区域内外的组织氧合测量值相差18.8%。
图5. 采用CWC系统进行皮肤组织氧合成像。 多光谱图像由CWC系统在同一受试者的同一皮肤位置采集，该位置与图4相同。左侧图像为皮肤组织的单波长图像，右侧图像为重建的皮肤组织氧合图。在皮肤上涂抹了一层浓度与图4相同的墨水。分别在墨水涂抹区域内部和外部选取了两个方形感兴趣区域（ROI）。在墨水涂抹区域内的ROI中，平均皮肤组织氧合水平为60.9±6.9%；在墨水涂抹区域外的ROI中，平均皮肤组织氧合水平为65.8±5.5%。在墨水涂抹皮肤区域内外测得的皮肤组织氧合值相差4.9%。
图6. 模拟皮肤颜色变化对皮肤组织氧合测量可靠性的影响。 采用统计分析方法评估模拟皮肤颜色变化对OxyVu和CWC成像系统氧合测量结果的显著性影响。对于每个成像系统，通过在每个区域随机选择10个感兴趣区域（ROIs），分别计算墨水涂覆皮肤区域内部和外部的平均皮肤组织氧合值。我们的零假设是皮肤颜色的变化不会影响皮肤组织氧合的测量结果。该零假设分别通过图4（即OxyVu测量结果）和图5（即CWC测量结果）中的氧合图进行检验。Student t检验结果显示，OxyVu测量的p值远小于0.001，表明应拒绝零假设。因此，皮肤颜色的变化确实会影响OxyVu成像系统中的皮肤组织氧合测量结果。相比之下，CWC测量的p值为0.728，表明皮肤颜色变化对CWC成像系统中的皮肤组织氧合测量结果无显著影响。
图7. 通过CWC系统在肢体缺血后反应性充血（PORH）期间获得的皮肤组织氧合图像。 PORH测试在一名健康受试者的前臂上进行，操作步骤遵循#1。(a) 前臂的单波长灰度图像，其上放置了四个基准标记，用于图像配准。(b) 血管阻断前采集的基础皮肤组织氧合图。(c) 血管阻断（收缩压+50 mmHg）2分钟后获得的皮肤组织氧合图。(d) 反应性充血后的皮肤组织氧合图。在血管阻断前、阻断期间及阻断后均观察到皮肤组织氧合的显著变化。
图8. PORH测试期间连续监测的组织氧参数。 （a）中的测试方案显示了测试过程，包括初始的基线期（阻塞前）、随后的超收缩压阻塞期，以及最后的反应性充血期。（b）中绘制了PORH过程中皮肤组织氧合状态的变化历程，数据通过对CWC皮肤氧合图中选定感兴趣区域（ROI）进行平均获得。我们还使用OxiplexTS组织血氧仪监测了深层组织氧合情况，结果如（c）所示。经皮组织氧张力则通过TCM设备进行监测，并在（d）中绘出。CWC对皮肤组织氧合的测量结果与其他氧参数在PORH过程中的变化具有良好的一致性。
图9. 不同血管阻塞压力下的皮肤组织反应。 在热刺激（即置于受试者左手的室温25°C水袋）移除后立即获取热成像图像。横轴对应热刺激移除后不同的时间点。纵轴对应以下4种血管阻塞压力水平：0（无阻塞）、0.5DBP、0.5(DBP+SBP)、1.5SBP，其中DBP为舒张压，SBP为收缩压。该特定受试者的DBP为69 mmHg，SBP为123 mmHg。测试结果表明，组织对体外热刺激的温度反应与血管阻塞程度相关。增加阻塞压力会降低热反应速率。
图10. 不同血管阻塞压力下的重建血管功能指数图。 血管功能指数（v）通过将皮肤组织温度变化（ΔT）对热刺激后时间的平方根（√t）进行回归分析得出，计算公式为：Δ √t + K + ε，其中ε为随机误差，K为常数。从左至右的血管功能指数图分别对应以下阻塞条件：（a）无阻塞，（b）0.5DBP，（c）0.5（DBP+SBP），（d）1.5SBP。该受试者的舒张压（DBP）为69 mmHg，收缩压（SBP）为123 mmHg。
图11. 血管功能指数与皮肤组织灌注之间的相关性。 受试者#2在每个阻塞压力下的指尖血管功能指数，是通过计算组织血管指数图中五个感兴趣区域（ROIs）的平均值得出的。皮肤组织灌注使用激光多普勒设备在其中一个指尖进行测量。指尖血管指数与激光多普勒测量结果呈正相关，表明动态热成像方法在组织血管功能定量评估方面具有应用潜力。
图12. 图像配准过程。 第一行显示：(a) 归一化后的照片，(b) 分割出的前景区域，以及 (c) 照片图像中分割出的标记点。第二行显示：(d) 归一化后的灌注图，(e) 分割出的前景区域，以及 (f) 灌注图中分割出的标记点。计算了两组标记点位置之间的仿射变换。通过应用该恢复出的仿射变换，对照片图像和氧图进行变换，得到配准后的图像 (g 和 h)。
图13. 共配准结果。 经变换的光学图像和氧合图，以及灌注图被共配准后以热图形式显示。图（a）中的热图由经变换的光学图像以100%强度显示在红色通道、经变换的氧合图像以100%强度显示在绿色通道、灌注图以50%强度显示在蓝色通道组成。为了更清晰地显示血管结构，我们提供了另一种共配准结果，如图（b）所示。该热图由经变换的光学图像以100%强度显示在红色通道、经变换的氧合图像以50%强度显示在绿色通道、以及经修改的灌注图以50%强度显示在蓝色通道组成，其中血管指数图被反转，且仅保留前景区域内的信息。
讨论
氧气在生物组织中以多种形式存在，例如与血红蛋白或肌红蛋白结合的氧、溶解氧以及活性氧。氧的运输在维持组织活性和正常代谢过程中起着关键作用3。急性轻度至中度缺氧会引发代谢适应、血管调节和促血管生成反应4。严重缺氧和无氧状态则会导致血管生成不足和细胞死亡。供氧受限与耗氧增加之间的失衡是多种疾病（如慢性伤口）的主要致病因素之一5。在缺血性伤口的情况下，由于灌注不足导致氧气供应受限，无法满足修复过程的代谢需求，并削弱了用于抗感染的呼吸爆发功能。对皮肤组织氧合状态和血管功能进行同步评估，在慢性伤口管理中具有重要的临床意义。
高光谱成像技术通过在不同波长下照射组织并检测组织的反射率来估算皮肤组织氧合水平6。高光谱成像的一个主要优势在于其能够无创、非接触地检测组织的功能特性。然而，许多高光谱成像系统的氧合测量可靠性会受到皮肤颜色及其他背景吸收变化的影响。宽间隔二阶导数光谱法此前已被开发用于组织氧合测量，可显著减少散射和皮肤色素沉着的干扰1。我们将二阶导数光谱法的原理应用于多光谱成像，并验证了在模拟皮肤颜色变化条件下，皮肤组织氧合水平的测量结果具有一致性。
既往通过测量组织热扩散率来研究组织灌注7。已开发出一种单罩法，用于施加热刺激并成像组织的动态响应，以估算皮肤组织的热惯性分布8。在人体前臂皮肤上进行的动脉袖带阻断实验表明，在血流阻断前后，热惯性与激光多普勒成像仪测得的血流灌注之间存在线性关系8。此外，还曾采用集总生物热模型来估算静脉阻断体积描记过程中指尖的血管反应性9。尽管已有上述研究，但从皮肤温度测量中量化皮肤血流灌注仍具挑战性，原因在于灵敏度不足、对皮下脂肪厚度的依赖性，以及其他影响因素，如血管收缩、血管舒张和运动伪影等10。在本实验方案中，我们采用红外相机捕捉皮肤组织在室温热刺激下的温度动态变化。所选热刺激条件旨在尽量减少血管收缩和血管舒张的影响。未来仍需进一步的建模与测量工作，以明确血管功能指数与皮肤组织灌注之间可靠的定量相关性。
在步骤#3中，我们使用仿射变换来完成图像配准任务。然而，由于两个相机在三维空间中以不同的角度放置，采用与这两个相机之间三维变换相关的转换方法可能会更加准确。目前我们正在探索这一方向，即利用对极几何对相机在三维空间中的外参进行标定。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 RO1 HL073087、GM 077185 和 GM 069589，授予 CKS。此外，还获得了 DHLRI 再生医学项目的资助。作者感谢以下来自俄亥俄州立大学的人员提供的技术支持和临床指导：Sabyasachi.Biswas 博士（综合伤口中心）、Allison Spiwak 博士（循环技术部）、Joseph Agoston（循环部）、Thoma Shives（循环部）、Joseph Ewing（机械工程系）、Scott Killinger（机械工程系）以及 Xiaoyin Ge（电气工程系）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Higgins 书法防水黑色墨水 | Sanford | 44314 | 稀释至 1% |
| Hamamatsu ORCA ER 深度制冷 CCD 相机 | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Varispec SNIR 液晶可调谐滤光片 | Cambridge Research Systems | VIS-10-HC-20 | |
| ThermoVision A40 红外相机 | FLIR Systems Inc. | A40 | |
| Thorlabs OSL1 高强度光纤光源 | Thorlabs Inc. | OSL1 |
参考文献
- Myers, D. E., Anderson, L. D., Seifert, R. P., Ortner, J. P., Cooper, C. E., Beilman, G. J. Noninvasive method for measuring local hemoglobin oxygen saturation in tissue using wide gap second derivative near-infrared spectroscopy. J Biomed Opt. 10 (3), 034017-034017 (2005).
- Jarm, T., Kragelj, R., Liebert, A., Lukasiewitz, P., Erjavec, T., Preseren-Strukelj, M. Postocclusive reactive hyperemia in healthy volunteers and patients with peripheral vascular disease measured by three noninvasive methods. Adv Exp Med Biol. 530, 661-669 (2003).
- Treacher, D. F., Leach, R. M. Oxygen transport-1. Basic principles. Bmj. 317 (7168), 1302-1306 (1998).
- Leach, R. M., Treacher, D. F. Oxygen transport-2. Tissue hypoxia. BMJ. 317 (7169), 1370-1373 (1998).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
- RL, G. reenman, Panasyuk, S., Wang, X., TE, L. yons, Dinh, T., Longoria, L. Early changes in the skin microcirculation and muscle metabolism of the diabetic foot. Lancet. 366 (9498), 1711-1717 (2005).
- Valvano, J. W. The use of thermal diffusivity to quantify tissue perfusion [dissertation]. , Massachusetts Institute of Technology. (1981).
- Hassan, M., Togawa, T. Observation of skin thermal inertia distribution during reactive hyperaemia using a single-hood measurement system. Physiol Meas. 22 (1), 187-200 (2001).
- Ley, O., Deshpande, C., Prapamcham, B., Naghavi, M. Lumped parameter thermal model for the study of vascular reactivity in the fingertip. J Biomech Eng. 130 (3), 031012-031012 (2008).
- Wilson, S. B., Spence, V. A. Dynamic thermographic imaging method for quantifying dermal perfusion: potential and limitations. Med Biol Eng Comput. 27 (5), 496-501 (1989).
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