活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

摘要

介绍了一种用于观察微循环的新颖且多功能的方法。该方法适用于长期观察，并可与药理生理学或分子生物学干预相结合。

摘要

背景：尽管已发明多种成像方式，体内微循环的调控因素及其详细生理机制仍未完全阐明。许多宏观血流参数反映的是血流速度，但在显微观察中，血流速度的变化与红细胞（RBC）流量之间并不呈线性关系。已有报道指出，在显微观察下，红细胞速度与红细胞流量之间、红细胞流量与血浆流体积之间存在不一致现象，且外周组织中的血流调节表现出空间和时间上的异质性。这些发现构成了利用活体显微镜对微循环调控进行更深入研究的科学依据。

方法：我们改进了Jeff Lichtman用于活体显微观察小鼠胸锁乳突肌的方法。小鼠经麻醉、通气，并注射PKH26L荧光标记的红细胞，以便进行显微观察。

结果与结论：通过宽场显微镜可清晰检测并区分荧光标记的红细胞。电刺激诱发的肌肉收缩引起红细胞流量增加。其他参数（包括红细胞流速和毛细血管密度）的定量分析亦可实现。小鼠对手术、注射标记红细胞、显微观察及电刺激均耐受良好。未观察到肌肉或血管损伤，表明本方法相对侵入性较小，适用于长期观察。

方案

红细胞膜染色

1. 从小鼠品系中采集经肝素抗凝处理的小鼠红细胞。
2. 使用 PKH26 染料（551/567 nm；Red fluorescent cell linker kit，Sigma，美国）对小鼠红细胞进行染色。
3. 将红细胞在 PBS 中洗涤后，与 2μM 的 PKH26 染料溶液在室温下孵育 5 分钟。通过加入预先在 65°C 下热灭活 1 小时的血浆终止反应，并继续孵育 1 分钟。
4. 染色后的红细胞用 PBS 洗涤 5 次。

小鼠准备

1. 本研究使用3至6月龄的雄性C57BL/10小鼠。通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。
2. 随后，将小鼠插入20号聚乙烯导管进行气管插管，实施机械通气，并置于连接热电偶传感器和反馈温控系统的Kapton加热板上，维持体温在37°C。
3. 剃除小鼠颈部腹侧毛发，暴露左右胸锁乳突肌。肌肉由不锈钢支架固定，并用无菌克氏任氏液进行灌流。

注射

1. 将染色的红细胞在37°C下温育，并用Krebs Ringer液稀释。从阴茎静脉向小鼠注射50 µl染色红细胞（红细胞比容为12%）。

骨骼肌的活体显微观察

我们采用 Jeff W. Lichtman 的方法并进行了修改^1:

1. 将动物置于尼康Eclipse-800显微镜自制定制铁架上的加热垫上。使用浸水物镜进行活体荧光透射观察。在汞灯荧光照射下，观察经PKH26标记的红细胞在血管内的流动情况。根据红细胞流动方向和血管结构特征，识别出初级小动脉、次级小动脉、毛细血管和静脉。
2. 安装增强型SIT相机（Hamamatsu Photonics，C2400，日本）和视频帧采集卡，以实时视频速率（每秒30帧）捕获低强度信号。图像以视频文件形式记录在DVD上。

肌肉刺激

1. 使用外周神经刺激器（Innervator 252，Fisher & Paykel Healthcare，新西兰）产生电脉冲，并通过镀层不锈钢探针传递至肌肉表面。负极探针端置于肌肉近端，正极探针端置于肌肉远端。以50 Hz频率给予5秒的强直刺激。电刺激未在接触区域附近引起直接的肌纤维损伤。

红细胞流速分析

1. 通过帧捕获软件（Video Savant，美国）将录制的DVD视频图像转换为Video Savant图像文件。以调整后的速度回放视频图像，以便观察单个染色的红细胞。通过计数每分钟流经一段聚焦的小动脉的红细胞数量来测量红细胞流速。

讨论

重要的技术要点如下：（1）维持动物的生理状态（通气、灌注液的pH值、体温），（2）染色红细胞的注射体积，以及（3）观察条件（最佳物镜选择、荧光强度）。潜在的未来应用包括：（a）与药理生理学和/或分子生物学干预手段相结合，（b）对动脉/小动脉硬化及新生血管形成的长期观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PKH26 染料		Sigma-Aldrich		551/567 nm；红色荧光细胞连接试剂盒
C57BL/10 小鼠	动物			3 至 6 月龄雄性
戊巴比妥				麻醉剂，50 mg/kg 体重，腹腔注射