器官型海马脑片培养模型是一种用于在多种实验范式中研究神经元损伤的体外模型。本文中，我们描述了制备脑片培养物以及定量神经元损伤的方法。
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本文内容
摘要
摘要
器官型海马切片培养是一种 体外 一种用于研究神经元损伤机制的方法，其中海马体的基本结构和组成得以相对保留 1器官型培养系统可用于研究神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，但作为一种 离体 制备过程未涉及血流影响或外周炎症细胞的募集。因此，该培养方法常用于研究海马锥体神经元的兴奋性毒性及缺氧性损伤，但也被用于研究炎症反应。本文描述了从出生后啮齿类动物脑组织制备海马脑片培养物的方法、施加毒性刺激以诱导神经元损伤的方法，以及检测与定量海马神经元死亡的技术。
方案
1. 准备
开始前，准备好所需的手术器械、分离和培养用培养基，以及出生7天的大鼠或小鼠幼崽。该方案适用于大鼠和小鼠的制备。
(i) 材料与仪器
- 手术剪（直剪，长 6 英寸，货号 RS6818，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 显微解剖剪（长 4 英寸，货号 RS5910，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 碳钢 Dumont 镊子（货号 RS-5045，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 改良玻璃“转移”移液管（移除巴斯德移液管底部并磨平边缘）
- 聚四氟乙烯薄膜，裁剪为 2 英寸 × 2 英寸的正方形（Honeywell，货号 812071，Pottsville，PA）
- 覆盖海绵，尺寸为 4 英寸 × 3 英寸（Kendall，货号 3157，Mansfield，MA）
- 30 mm Millicell 膜插件（孔径 0.4 μm；Millipore，Bedford，MA）
- Mcllwain 组织切片机，配备双刃剃须刀片（McILwain 组织切片机，Vibratome Company，St. Louis，MO）
- 倒置显微镜，配备 CCD 相机及图像分析软件
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讨论
在重复实验时，为确保结果具有可重复性和一致性，需遵循两个重要原则。首先，海马脑片在用于实验前应培养 12–14 天。在脑片分离过程中会引发显著的小胶质细胞反应，这些小胶质细胞在一段时间内保持活化状态，通常在体外培养第 10 天左右才恢复至静息的分支状形态in vitro 3,6。其次，碘化丙啶（PI）荧光平均强度与受损细胞数量成正比4。荧光信号在三个时间点进行连续测量：（i）T0 时，即在给予 NMDA 或氧糖剥夺（OGD）刺激之前，用于测定神经元自发性死亡的基础水平；（ii）T24 时，即在 NMDA、OGD 或其他刺激后 24 小时；（iii）Tmax 时，在脑片接受终末处理后进行测量，该处理为加入 10 μM NMDA 进行 24 小时的致死性孵育，以诱导最大程度的神经元死亡。随后，通过公式 (T24 - T0) / (Tmax - T0) 计算细胞死亡百分比。使用此方法将每一片脑片自身进行归一化处理至关重要，因为从脑.......
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致谢
由美国国家神经疾病与中风研究所（NINDS）、美国心脏协会、美国衰老研究联合会、玛氏基金会资助
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参考文献
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24....
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