器官型海马脑片培养模型是一种用于在多种实验范式中研究神经元损伤的体外模型。本文中，我们描述了制备脑片培养物以及定量神经元损伤的方法。
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摘要
摘要
器官型海马切片培养是一种 体外 一种用于研究神经元损伤机制的方法，其中海马体的基本结构和组成得以相对保留 1器官型培养系统可用于研究神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，但作为一种 离体 制备过程未涉及血流影响或外周炎症细胞的募集。因此，该培养方法常用于研究海马锥体神经元的兴奋性毒性及缺氧性损伤，但也被用于研究炎症反应。本文描述了从出生后啮齿类动物脑组织制备海马脑片培养物的方法、施加毒性刺激以诱导神经元损伤的方法，以及检测与定量海马神经元死亡的技术。
方案
1. 准备
开始前，准备好所需的手术器械、分离和培养用培养基，以及出生7天的大鼠或小鼠幼崽。该方案适用于大鼠和小鼠的制备。
(i) 材料与仪器
- 手术剪（直剪，长 6 英寸，货号 RS6818，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 显微解剖剪（长 4 英寸，货号 RS5910，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 碳钢 Dumont 镊子（货号 RS-5045，Roboz，Gaithersburg，MD）
- 改良玻璃“转移”移液管（移除巴斯德移液管底部并磨平边缘）
- 聚四氟乙烯薄膜，裁剪为 2 英寸 × 2 英寸的正方形（Honeywell，货号 812071，Pottsville，PA）
- 覆盖海绵，尺寸为 4 英寸 × 3 英寸（Kendall，货号 3157，Mansfield，MA）
- 30 mm Millicell 膜插件（孔径 0.4 μm；Millipore，Bedford，MA）
- Mcllwain 组织切片机，配备双刃剃须刀片（McILwain 组织切片机，Vibratome Company，St. Louis，MO）
- 倒置显微镜，配备 CCD 相机及图像分析软件
（ii）解剖液（DM；1 升，pH 7.3）
| 汉克平衡盐 | 1 小瓶 (95.2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO3 (4.2 mM) | 350 mg |
| HEPES (10 mM) | 2.83 g |
| 葡萄糖 (33.3 mM) | 6.0 g |
| 青霉素/链霉素 (100×) | 10 mL |
| BSA (0.3%) | 300 mg |
| MgSO4-7H2O | 1.44 g |
（iii）培养基（400 mL）
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 mL |
| ***Hank's Balance Salt (Invitrogen 24020-117) | 100 mL |
| 马血清 (Invitrogen 26050-070) | 100 mL |
| HEPES缓冲液 (1 M; Invitrogen 15630-080) | 5 mL |
| 青霉素/链霉素 (100倍浓缩液) | 4 mL |
| ***配制培养基前，向500 mL Hank's Balance Salt中加入12.8 g葡萄糖 | |
（iv）动物
出生后7天大的大鼠或小鼠幼崽，通常每次实验使用一窝。
2. 培养当天操作步骤
- 所有解剖工具和Aclar膜在使用前必须用70%乙醇浸泡30分钟。解剖罩表面、刀片和组织切片机必须用乙醇消毒。
- 准备若干（3–4个）6孔细胞培养板；每孔加入1 mL培养基，并在每孔中插入一张Millipore可渗透膜。将6孔板置于37°C培养箱中，待准备转移脑片时取出使用。
- 准备若干（4–6个）60 mm培养皿，加入DM后置于冰上。
- 迅速用剪刀断头，并将头部浸入70%乙醇中，通过颅骨矢状切口快速暴露大脑。小心取出脑组织并立即放入冷DM中。将脑组织分离为两个半球，将每个半球内侧朝下放置在覆盖海绵上约2–3秒。
- 轻轻提起半球并将其放置于Aclar膜片上，然后置于组织切片机上；以冠状面将脑组织切成350 μm厚的切片。完成后，轻轻拿起带有切片脑半球的Aclar膜片，浸入冷DM中。
- 在解剖显微镜下分离出海马区切片。大鼠应获得5个从前脑到后脑连续分布的海马切片，小鼠则应获得3–4个海马切片。
- 从37°C细胞培养孵育箱中取出带有膜插件的6孔板。使用玻璃转移移液管将海马切片逐个转移至可渗透膜上。若过多DM被带至膜上，可用巴斯德移液管吸除多余液体。每张膜上放置5个海马切片。每种实验条件至少使用3个孔，即15个切片。
- 将培养板置于37°C、5% CO的湿润培养箱中孵育12–14天，之后开始进行毒性实验。培养基可每周更换两次。
3. 在脑片培养中诱导并量化海马神经元损伤
- 培养 12–14 天后，向培养基中加入 5 μg/mL 碘化丙啶（PI）。此步骤可用于观察和定量基础性细胞死亡。
- 次日，定量每个海马脑片 CA1 亚区（以及根据需要可包括 CA3 或齿状回）的 PI 荧光强度，并获得代表基础性细胞死亡的平均 PI 荧光测量值（记为时间 = 0 小时，或 T0）。图像采集与定量分析可使用 OpenLab 软件（Improvision，英国），但也可采用其他图像采集与分析软件来量化荧光强度。
- 在完成 T0 时间点的 PI 荧光图像采集后，立即采用您选定的方法诱导神经元损伤（我们曾使用 10 μM NMDA、缺氧-缺糖或 LPS 处理一小时以诱导神经毒性2,5）。在毒性刺激后，更换为含 5 μg/mL PI 的新鲜培养基，并将脑片继续培养过夜。
- 第 3 天，定量实验条件下 24 小时（即 T24）的平均 PI 荧光强度。
- 完成此次图像采集后，立即更换培养基，加入 10 μM NMDA 和 5 μg/mL PI，并将脑片继续孵育过夜，以达到最大神经元死亡程度。
- 第 4 天，定量最大神经元死亡状态下的平均 PI 荧光强度，定义为 Tmax。按以下公式计算细胞死亡百分比：(T24 - T0) / (Tmax - T0)。
4. 代表性结果
图1. （A）海马体切片制备、后续实验性损伤及图像采集的时间线。（B）海马体切片在基础状态（T0）、经10 μM NMDA处理1小时后24小时（T24），以及再次暴露于10 μM NMDA持续24小时以达到最大神经元损伤时（Tmax）的代表性图像。
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讨论
在重复实验时，为确保结果具有可重复性和一致性，需遵循两个重要原则。首先，海马脑片在用于实验前应培养 12–14 天。在脑片分离过程中会引发显著的小胶质细胞反应，这些小胶质细胞在一段时间内保持活化状态，通常在体外培养第 10 天左右才恢复至静息的分支状形态in vitro 3,6。其次，碘化丙啶（PI）荧光平均强度与受损细胞数量成正比4。荧光信号在三个时间点进行连续测量：（i）T0 时，即在给予 NMDA 或氧糖剥夺（OGD）刺激之前，用于测定神经元自发性死亡的基础水平；（ii）T24 时，即在 NMDA、OGD 或其他刺激后 24 小时；（iii）Tmax 时，在脑片接受终末处理后进行测量，该处理为加入 10 μM NMDA 进行 24 小时的致死性孵育，以诱导最大程度的神经元死亡。随后，通过公式 (T24 - T0) / (Tmax - T0) 计算细胞死亡百分比。使用此方法将每一片脑片自身进行归一化处理至关重要，因为从脑...
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致谢
由美国国家神经疾病与中风研究所（NINDS）、美国心脏协会、美国衰老研究联合会、玛氏基金会资助
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参考文献
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
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重印与许可
