在许多情况下，可以通过使用先进的从头折叠（ab initio）折叠算法对HIV-1表面包膜糖蛋白（gp120）V3环第10至22位氨基酸进行计算机模拟折叠，从而在结构上表征不同V3环序列的冠状区域。本文中，我们展示了HIV-1 R2株V3环该区域的折叠与评估，R2株是一种具有独特中和敏感性且功能特性令人困惑的毒株。
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摘要
摘要
HIV-1 的抗原多样性长期以来一直是疫苗设计的障碍，这种变异性在病毒表面包膜糖蛋白的 V3 环区域尤为显著。我们此前提出，尽管 V3 环的顶端结构具有动态性和序列可变性，但在所有流行的 HIV-1 病毒中，其顶端被限制为一种具有免疫学意义的 β-发夹三级结构。重要的是，在目前流行的 HIV-1 病毒中存在数千种不同的 V3 环顶端序列，这使得通过晶体学或核磁共振（NMR）方法对病毒多样性中的结构趋势进行三维结构表征变得困难甚至不可能。我们此前关于 V3 顶端折叠的成功研究1, 2采用了 ICM-Pro 分子建模软件包（Molsoft LLC, La Jolla, CA）中可访问的ab initio算法3，结果表明，V3 环的顶端（特别是第 10 至 22 位氨基酸）由于其侧翼茎区具有足够的灵活性和长度，在很大程度上表现得如同溶液中自由折叠的无约束肽段。因此，对 60,000 多种流行 HIV-1 毒株中任意一种毒株的 V3 环这一区域进行快速ab initio折叠，均可提供有价值的信息。在此，我们对 R2 毒株的 V3 环进行了折叠，以深入了解其独特性质的结构基础。R2 毒株携带一种罕见的 V3 环序列，被认为与其对患者血清和单克隆抗体中和作用的高度敏感性有关4, 5。该毒株可介导 CD4 非依赖性感染，并似乎能够诱导广谱中和抗体。我们展示了如何通过评估折叠结果，将折叠过程中观察到的结构与 R2 毒株所表现出的免疫学活性相关联。
方案
1. 方法
- 本方案的第一步是选择您希望在计算机中进行折叠的 V3 冠状序列。对于 R2 菌株，该片段的序列为 KSIPMGPGRAFYT。
- 应在计算机的虚拟空间中构建对应于此序列的肽段三维原子结构。实现此操作的 ICM 命令为：
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
或者可在下拉菜单中选择 文件:新建:肽段 - 随后需设置该过程的多个参数，包括搜索步数（搜索长度）、模拟温度、搜索策略参数（如可变约束以引导搜索趋向合理区域）、能量项、不同能量计算方法的选择，以及指示搜索记录方式的参数（例如是否记录动画，以及应记录多少个中间评分构象）。这些参数均已通过先前发表的研究优化（参见 www.molsoft.com）。
- 然后使用以下命令启动折叠过程：
montecarlo
或者可在下拉菜单中选择 分子力学:最小化:全局
在前一种情况下，第 3 步中的参数需在命令行中逐一设置；在后一种情况下，系统会在执行命令前的面板中提供最常用参数的复选框。为方便起见，本实验及先前发表实验所使用的相同折叠 ICM 脚本如下所示：
该脚本可保存为文本文件，并通过操作系统命令行（通常为 LINUX）使用以下命令快速运行：
icm _foldingscript
2. 成功的秘诀
- 几乎所有已知毒株的V3环长度恒定为35个氨基酸，因此氨基酸位置从1到35编号，起始于第1位由二硫键连接的半胱氨酸，终止于第35位对应的二硫键连接的半胱氨酸。由于V3环属于环状结构，其V3环冠部边界的选取应谨慎。若选取的片段过大，则该片段在模拟中难以像游离肽段一样自由灵活，导致折叠模拟无法准确评估其结构；若选取的片段过小，则可能无法在模拟中形成具有信息意义的三级结构。我们先前的研究表明，第10至第22位的片段与抗体结合晶体结构的构象高度相关，因此任何V3环折叠模拟均应选择该区段。
- 尽管使用图形用户界面和下拉菜单操作较为友好，但以往在ICM中进行肽段折叠（特别是V3环冠部折叠）的成功研究均采用上述脚本方式，因此建议直接修改buildpep行中的序列，并通过命令行运行上述脚本。
3. 代表性结果
R2折叠的结果具有任何V3环结果的代表性。为评估结果，应打开项目文件（根据上述脚本，文件名为“newProject1.icb”），并选择“分子力学，构象堆栈，查看”。此时将出现一个包含构象堆栈的表格。通过点击“绘图/直方图”图标，可图形化地可视化堆栈中的构象。选择“分子力学，构象堆栈，播放”可生成构象堆栈的动画，从而直观地观察折叠所揭示的构象偏好。对于R2序列，其构象呈β-发夹样，这与V3环的预期一致2——尤其在第12至14位的片段中，整个堆栈均显示出清晰的β-链偏好，而α-螺旋构象极少出现。此外，最低能量构象与第二低能量构象之间存在近3个单位的能量差。从能量角度看，这意味着该结构在低于百分之一的时间内才会短暂偏离最低能量构象：因此，折叠结果表明R2 V3冠区是一种刚性而非柔性的结构。在构象集合中可能存在其他重要的结构特征，但它们难以被系统性地识别。
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
表1： JRFL 和 R2 V3 环在屏蔽与非屏蔽条件下的相对中和作用。数据先前发表于 Cardozo T.，等，ARHR (2008) 以及 Pinter A.，等，J. Virol (2004)。简言之，中和活性通过单周期感染性实验测定，所用假病毒（psVs）由携带 env 缺陷型荧光素酶表达质粒 pNL4-3.Luc.R-E- 并假型化为 JRFL Env 或上述 SF162 V3 变体构建而成：SF162_V3JRFL 是将 JRFL 的 V3 环序列替换 SF162 的 V3 环序列；SF162_V3R2 是将 R2 的 V3 环序列替换 SF162 的 V3 环序列。将 psVs 与 447-52D 单克隆抗体进行系列稀释后，在 37°C 下孵育 1.5 小时，随后加入含聚凝胺（10 mg/mL）的 96 孔板中培养的 CD4+CCR5+ U87 靶细胞。24 小时后，更换为含 10% 胎牛血清和 10 mg/mL 聚凝胺的 RPMI 培养基，继续孵育 24–48 小时。感染后 48–72 小时，使用 Promega 公司的检测试剂，通过微孔板发光仪（HARTA, Inc.）测定荧光素酶活性。447-52D 抗体介导的 50% 中和的几何平均滴度（GMT50）通过中和曲线插值法确定，结果为至少三次独立实验的平均值。
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讨论
从头折叠能够揭示蛋白质的三级结构特性，而这些特性仅通过逐个研究氨基酸序列可能无法显现。通过折叠模拟，揭示了R2 V3环冠 previously obscure 的若干结构特性。这些观察到的结构倾向可能与R2毒株的已知功能特性相关，即对中和作用的敏感性以及高感染性5。
首先，在R2 V3冠状区N端一半的第12至14位位置观察到明显的β-链倾向。该位置正是R2毒株特有的异亮氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸（IPM）序列所在区域。根据447-52D、2219、Be48、2557、2558和537-D等抗V3环抗体与V3环肽结合的晶体结构显示，这些抗体结合于V3环的第12至14位；在结合状态下，该片段呈现局部β-链构象。因此，折叠模拟结果表明，R2 V3环冠状区在第12至14位倾向于形成一种与已知抗V3环中和抗体互补的构象。这种构象偏好可能解释了该毒株对中和作用的敏感性。
其次，模拟结果显示，最低能量构象与第二低能量构象之间存在3个能量单位的差距，表明该结构较为刚性。HIV-1的gp120是一种高度动...
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致谢
本研究由比尔和梅琳达·盖茨基金会（#38631）以及美国国立卫生研究院（NIH）的资助支持，包括DP2 OD004631和R01 AI084119项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
参考文献
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
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