通过灌胃法口服给予鱼藤酮及肠道神经系统中α-突触核蛋白包涵体的图像分析

摘要

帕金森病与接触农药有关。本文介绍了一种通过胃管以所需浓度递送农药的方法，以及一种分析农药对肠神经系统中α-突触核蛋白聚集影响的方法。

摘要

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者中，相关病理变化遵循一种特征性模式，涉及肠神经系统（enteric nervous system, ENS）^1,2、嗅球（olfactory bulb, OB）、迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus, DMV）³、脊髓中间外侧核⁴以及黑质，这些构成了该病神经病理学分期的基础^4,5。ENS 和 OB 是最暴露的神经结构，也是最早受累的部位。有趣的是，帕金森病已被发现与农药暴露相关^6-8。本文详细描述了我们在先前研究中使用的两种方法⁹。为了分析鱼藤酮在肠神经系统局部作用的影响，我们通过灌胃方式向一岁的 C57/BL6 小鼠给予鱼藤酮。鱼藤酮是一种广泛使用的农药，可强烈抑制线粒体复合物 I 活性¹⁰，具有高度脂溶性，在胃肠道中吸收较差¹¹。我们的结果显示，给予 5 mg/kg 剂量的鱼藤酮并未抑制肌肉或脑组织中线粒体复合物 I 的活性，提示采用本给药方法时，鱼藤酮未进入肝门静脉系统，仅作用于 ENS。本文展示了通过灌胃给予农药的方法，以及用于分析农药对 ENS 中 α-突触核蛋白聚集影响的图像分析流程。第一部分介绍了一种可精确控制浓度进行胃内农药（鱼藤酮）给药的方法；第二部分介绍了一种半自动化的图像分析流程，利用图像分析软件对 ENS 中 α-突触核蛋白的聚集情况进行定量分析。

方案

1) 罗丹明内毒素的胃内给药

1. 称量动物体重。
2. 计算所需鱼藤酮/溶剂溶液的总体积。本实验中为每克动物体重0.01 ml。
3. 用1 mL注射器吸取先前计算好的鱼藤酮溶液（0.625 mg/mL鱼藤酮，4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）或溶剂溶液（4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）体积。本实验中相当于给予5 mg/kg剂量的鱼藤酮。
4. 抓取小鼠，一手握住小鼠尾巴，另一只手用前两指拉住颈部皮肤使其伸展。
5. 当头部被固定于两指之间后，将其靠在手掌上并翻转至倒置位置，用第四和第五指固定尾巴。
6. 保持头部朝向后方，按压腭部以打开小鼠口腔。轻柔地将灌胃针插入小鼠口中。注意必须使用灌胃针而非普通针头。缓慢将灌胃针沿食道方向推进至足够深度，以避免液体进入肺部。
7. 通过轻压注射器推杆给予鱼藤酮溶液或溶剂。给药完成后，缓慢拔出灌胃针。
8. 将动物放回另一笼中，直至同一笼内所有动物处理完毕。

2）免疫染色步骤

1. 处理后，小鼠通过腹腔注射 Ketamin 100 mg/kg 和 Xylazin 10 mg/kg 进行麻醉，并经心脏灌注 4% 多聚甲醛 PBS 溶液。
2. 随后通过解剖取出肠道组织，置于 15% 蔗糖溶液中过夜。次日，将组织转移至 30% 蔗糖溶液中，于 4°C 再次孵育过夜。
3. 然后....

讨论

胃内给药此前已有报道¹²。然而，根据Inden的论文，鱼藤酮是单独溶解于0.5%羧甲基纤维素钠盐（CMSS）中进行给药的。鱼藤酮是一种高度脂溶性的物质，因此无法单独溶解于0.5% CMSS中，若如此操作将导致沉淀。使用氯仿可形成均匀分布的鱼藤酮混悬液，避免沉淀产生。此外，由于在CMSS中农药浓度更高，所给予溶液的最终体积也显著减少，从而降低了给药过程中的并发症风险。

我们推荐使用直头灌胃针。小鼠的食道呈直线状，直接通向胃的一侧。因此，直头灌胃针更适合此操作。

使用FIJI软件对共聚焦图像进行图像分析。该软件的插件可在线下载。用于图像分析的免疫荧光染色按照先前描述的方法进行⁹。图像使用LSM 510 Zeiss共聚焦显微镜获取。重要的是，图像应在相同的信噪比条件下获取，这可通过在采集前调整增益和偏移来实现。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	德国
氯仿	Carl Roth GmbH	3313.1	德国
羧甲基纤维素	Sigma-Aldrich	C5678	德国
灌胃针 1.2 mm x 60 mm	Unimed		瑞士
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de