通过灌胃法口服给予鱼藤酮及肠道神经系统中α-突触核蛋白包涵体的图像分析

摘要

帕金森病与接触农药有关。本文介绍了一种通过胃管以所需浓度递送农药的方法，以及一种分析农药对肠神经系统中α-突触核蛋白聚集影响的方法。

摘要

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者中，相关病理变化遵循一种特征性模式，涉及肠神经系统（enteric nervous system, ENS）^1,2、嗅球（olfactory bulb, OB）、迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus, DMV）³、脊髓中间外侧核⁴以及黑质，这些构成了该病神经病理学分期的基础^4,5。ENS 和 OB 是最暴露的神经结构，也是最早受累的部位。有趣的是，帕金森病已被发现与农药暴露相关^6-8。本文详细描述了我们在先前研究中使用的两种方法⁹。为了分析鱼藤酮在肠神经系统局部作用的影响，我们通过灌胃方式向一岁的 C57/BL6 小鼠给予鱼藤酮。鱼藤酮是一种广泛使用的农药，可强烈抑制线粒体复合物 I 活性¹⁰，具有高度脂溶性，在胃肠道中吸收较差¹¹。我们的结果显示，给予 5 mg/kg 剂量的鱼藤酮并未抑制肌肉或脑组织中线粒体复合物 I 的活性，提示采用本给药方法时，鱼藤酮未进入肝门静脉系统，仅作用于 ENS。本文展示了通过灌胃给予农药的方法，以及用于分析农药对 ENS 中 α-突触核蛋白聚集影响的图像分析流程。第一部分介绍了一种可精确控制浓度进行胃内农药（鱼藤酮）给药的方法；第二部分介绍了一种半自动化的图像分析流程，利用图像分析软件对 ENS 中 α-突触核蛋白的聚集情况进行定量分析。

方案

1) 罗丹明内毒素的胃内给药

1. 称量动物体重。
2. 计算所需鱼藤酮/溶剂溶液的总体积。本实验中为每克动物体重0.01 ml。
3. 用1 mL注射器吸取先前计算好的鱼藤酮溶液（0.625 mg/mL鱼藤酮，4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）或溶剂溶液（4%羧甲基纤维素钠和1.25%氯仿）体积。本实验中相当于给予5 mg/kg的鱼藤酮剂量。
4. 抓取小鼠，一手握住小鼠尾巴，另一只手用前两指拉住颈部皮肤使其伸展。
5. 当头部被固定于两指之间后，将其靠在手掌上并翻转至倒置位置，用第四和第五指固定尾巴。
6. 保持头部朝向后方，按压腭部以打开小鼠口腔。轻柔地将灌胃针插入小鼠口中。注意必须使用灌胃针而非普通针头。缓慢将灌胃针沿食道方向推进至足够深度，以避免液体进入肺部。
7. 轻轻推动注射器活塞，注入鱼藤酮溶液或溶剂。操作完成后，缓慢拔出灌胃针。
8. 将小鼠放回另一笼中，待同一笼内所有小鼠处理完毕后再统一安置。

2）免疫染色步骤

1. 处理后，小鼠通过腹腔注射 Ketamin 100 mg/kg 和 Xylazin 10 mg/kg 进行麻醉，并经心脏灌注 4% 多聚甲醛 PBS 溶液。
2. 随后通过解剖取出肠道组织，置于 15% 蔗糖溶液中过夜。次日，将组织转移至 30% 蔗糖溶液中，于 4°C 再次孵育过夜。
3. 然后将组织置于组织包埋剂（Tissue-tek）中，保存于 -80°C 超低温冰箱中备用。
4. 使用冷冻切片机将 20 微米厚的肠组织横切面转移至 Superfrost 载玻片上。
5. 随后按照先前所述方法 ⁹ 进行封闭和免疫染色操作，所用抗体为抗-βIII-微管蛋白（anti-βIII-tubulin）和抗-α-突触核蛋白（anti-alpha-synuclein）抗体。

3) α-突触核蛋白包涵体图像分析

建议由不了解图像来源的外部人员进行分析，因此应对数据进行编码。图像分析使用 FIJI 软件完成。

1. 打开共聚焦图像文件，然后拆分通道，以便能够独立地对每个通道进行操作。
2. 关闭不使用的通道，选择“分析>设置尺度”，并将像素大小设为 1。将已知距离设为 0.13（该数值取决于所使用的物镜和分辨率），然后点击“全局”。此时图像尺寸将以微米显示。
3. 选择 α-突触核蛋白通道，并选中神经节，确保在所有切片中选择区域完全包围该神经节。
4. 按下“图像>复制”以复制图像。在神经节被选中的情况下，仅会复制与神经节大小相同的图像区域。
5. 按下“编辑>清除外部”。图像选区以外的部分将变为黑色。
6. 再次复制图像，以便在后续步骤中评估操作效果。信噪比过高或背景过强的图像不应用于图像分析。
7. 选择“图像>调整>阈值”，然后选择“最大熵”方法。随后在裁剪后的图像和原始图像之间切换切片，以确认操作效果良好。“最大熵”阈值根据图像直方图选择一个强度信号水平，只有强度高于该阈值的像素才会在黑白图像中以白色显示。
8. 选择“处理”，然后点击“平滑”。此步骤将图像的像素化边缘转换为平滑边缘。
9. 选择“处理”，然后点击“二值化”，并选择“转换为二值图像”。图像将以黑底白图的形式显示。
10. 复制图像，以便在复制的图像上执行下一步操作。
11. 点击“分析>分析颗粒”。然后选择“显示：轮廓”，并点击“汇总”。其余设置保持默认。该功能可识别出具有信号的总像素数以及彼此相连的像素群组。结果将报告具有信号的像素总面积、像素群组总数以及平均颗粒大小。
12. 比较并选择最符合要求的最大切片，该切片将被标记。
13. 复制包含总 α-突触核蛋白面积、包涵体数量和平均颗粒大小的数据表。将数据粘贴至 Excel 表格或其他位置进行记录。
14. 返回 FIJI，找到 β-微管蛋白通道中先前选定的切片，并进行选中。
15. 选择神经节区域，点击“分析”，然后选择“测量”。将出现另一个表格，显示神经节的总面积。
16. 将该表格中的数据提取至 Excel 表格中，紧邻 α-突触核蛋白的测量数据，或在其他位置记录。
17. 在 Excel 中，将 α-突触核蛋白测量所得的各项参数除以神经节面积，从而获得经神经节大小归一化的总 α-突触核蛋白面积和包涵体数量。

4) 代表性结果

当灌胃给药操作正确时，对动物造成的不适最小。使用该浓度的鱼藤酮可在肠神经系统（ENS）上产生局部作用，而血液中无鱼藤酮残留，即使经过1.5个月的治疗，也不会抑制肌肉或脑组织线粒体复合物I的活性（见图1）。若图像分析操作得当，应能对α-突触核蛋白的分布模式进行严谨分析。该方法可提供关于α-突触核蛋白总量（总面积）、细胞内α-突触核蛋白分布模式（包涵体数量）以及α-突触核蛋白包涵体存在情况（包涵体大小）的可靠数据（图2）。

图 1. 经鱼藤酮处理的小鼠出现运动功能障碍，但在血液或中枢神经系统中未检测到鱼藤酮。A， 标准品（50 ng/mL）以及来自接受 20、10 和 5 mg/kg 剂量处理小鼠脑组织样本的色谱图。B 和 C，血液（B）和中枢神经系统（C）中鱼藤酮水平的定量分析。B，给药后 1、2 和 3 小时的血液浓度。将小鼠分为三组（n=3），分别给予 2.5、5、10 和 20 mg/kg 的鱼藤酮（n=3），在鱼藤酮给药后 1、2 和 3 小时采集各 300 μL 血液样本并混合后用于 HPLC 分析。C，小鼠每日给药一次，连续一周，分别使用 5（n=3）、10（n=3）和 20（n=1）mg/kg 的鱼藤酮处理，在最后一次给药后 1 和 2 小时分别取脑组织和脑干组织，并制备用于 HPLC 分析。D，经 1.5 个月鱼藤酮处理后小鼠肌肉和脑组织样本中线粒体复合物 I 的活性。

图 2. 局部给予鱼藤酮可诱导肠神经系统（ENS）神经节中α-突触核蛋白的磷酸化、积聚和聚集，并伴有胶质增生。（比例尺为 20 μm）。A, B, C，十二指肠（B）和回肠（A, C）切片中抗 βIII-微管蛋白、α-突触核蛋白及 DAPI 染色结果。图 B 中箭头所示：与对照组（3 个月，A）相比，经 1.5 个月处理后，肠神经系统神经节内出现更明显的α-突触核蛋白点状分布模式。图 C 中箭头所示：经 3 个月处理后，形成较大的α-突触核蛋白包涵体（直径>6 μm）。D，使用抗α-突触核蛋白抗体、硫黄素 S 和 DAPI 进行免疫荧光染色。图 D 中箭头所示：仅在经 3 个月处理的小鼠中观察到这些较大α-突触核蛋白积聚物的聚集现象。E, E', E''，图像分析定量步骤。E，用于定量分析的图像示例，显示一个经α-突触核蛋白免疫染色的 ENS 神经节，可见不同包涵体。E'，图像分析流程完成后获得的图像示例。E''，原始包涵体（绿色）与流程分析后所得结果（黄色线条）之间的部分重叠。F-G，对 A-C 所示实验进行定量分析，采用自动分割和基于熵的阈值设定方法。单星号表示 P<0.05，双星号表示 P<0.01。F，每根柱代表每个神经节中α-突触核蛋白总面积与神经节总面积之比。G，每根柱代表每个神经节单位面积内α-突触核蛋白包涵体的总数。所有图表均显示均值 ± 标准误（s.e.m.）。

讨论

胃内给药此前已有报道¹²。然而，根据Inden的论文，鱼藤酮是单独溶解于0.5%羧甲基纤维素钠盐（CMSS）中进行给药的。鱼藤酮是一种高度脂溶性的物质，因此无法单独溶解于0.5% CMSS中，若如此操作将导致沉淀。使用氯仿可形成均匀分布的鱼藤酮混悬液，避免沉淀产生。此外，由于在CMSS中农药浓度更高，所给予溶液的最终体积也显著减少，从而降低了给药过程中的并发症风险。

我们推荐使用直头灌胃针。小鼠的食道呈直线状，直接通向胃的一侧。因此，直头灌胃针更适合此操作。

使用FIJI软件对共聚焦图像进行图像分析。该软件的插件可在线下载。用于图像分析的免疫荧光染色按照先前描述的方法进行⁹。图像使用LSM 510 Zeiss共聚焦显微镜获取。重要的是，图像应在相同的信噪比条件下获取，这可通过在采集前调整增益和偏移来实现。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	德国
氯仿	Carl Roth GmbH	3313.1	德国
羧甲基纤维素	Sigma-Aldrich	C5678	德国
灌胃针 1.2 mm x 60 mm	Unimed		瑞士
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de