监测昆虫抗药性的生物测定方法

摘要

本文展示并讨论了用于调查节肢动物害虫对触杀型和内吸型杀虫剂的敏感性及检测其抗药性的技术。

摘要

害虫对杀虫剂的抗性日益严重，因为杀虫剂是高产农业体系中不可或缺的一部分。当特定作物系统中可用于防治某种害虫的药剂种类有限时，化学防治的选择也相应受限。因此，相同的一种或多种药剂会被反复使用，从而对靶标害虫持续施加选择压力。抗性种群的出现会带来经济和环境方面的双重代价。据估计，仅在美国，杀虫剂抗性造成的损失每年约为15亿美元。本文将介绍目前用于监测节肢动物（特别是昆虫）种群抗性发展的实验方案。成虫小瓶检测法用于测定触杀型杀虫剂的毒性，该方法经适当修改后也可用于植物系统性杀虫剂的检测。在这些生物测定中，昆虫暴露于工业级纯度的杀虫剂后，在特定的暴露时间间隔后记录其反应（死亡率）。死亡率数据通过剂量对数-概率分析法（Log Dose probit analysis）进行处理，以估算导致50%靶标种群死亡的致死浓度（LC₅₀），并计算一系列置信区间（CL's）作为数据变异性的评估指标。当这些数据来自多种对杀虫剂敏感的昆虫种群时，所得LC₅₀值可作为今后监测工作的基线数据。在种群接触过药剂后，可采用相同的方法将其结果与先前确定的LC₅₀值进行比较。

方案

1. 引言

随着认识到到2025年全球人口将达到80.4亿人¹，食品生产已变得至关重要。届时需要提供比目前产量更多的粮食作物。若不使用农药等植物保护产品来提高作物产量并维持其品质，将无法实现充足的粮食供应。基于历史上及当前对农药的依赖，农药抗性现象将持续发生，并在科学文献中不断被报道。

害虫对农药产生抗性是一个棘手的问题，因为农药是实现高产和优质农业生产的重要组成部分。然而，农药的过度使用和/或不当使用可能导致抗性的发展，从而对作物生产造成不利影响。害虫（如昆虫、杂草、病原体等）可通过多种机制产生抗性，但抗性发展的主要驱动因素之一是缺乏具有独立作用机制且已注册可用于防治的农药¹。当特定作物系统中针对某一特定害虫登记的农药种类较少时，化学防治的选择就十分有限。因此，只能反复使用相同的化学物质，使害虫持续受到选择压力。当该害虫在一年内有多代繁殖，且每一代都暴露于农药环境中时，这一问题将进一步加剧。

抗性会带来经济和环境方面的代价²。害虫抗性导致为实现有效防治而需要更高剂量、更频繁地施用农药。即使增加农药使用量，仍可能因无法有效控制靶标害虫而导致产量损失。Pimentel² 估计，美国每年因农药抗性造成的损失约为 15 亿美元。

对害虫种群的杀虫剂敏感性进行监测是一种主动方法，可用于检测杀虫剂效果的任何变化，并为调整化学防治策略提供早期预警。通过调整整体的有害生物综合治理（IPM）策略，可以延长特定杀虫剂的有效使用期限，进而有助于农业持续为全球提供充足的粮食和纤维。本文将介绍一种可用于监测杀虫剂敏感性并检测杀虫剂抗性种群发展的实验方案，该方案采用成虫小瓶法³检测触杀型杀虫剂，以及对该方法进行改良后用于植物内吸性杀虫剂的检测方法⁴。

2. 方法

2.1 安全声明

处理杀虫剂时，采取适当的安全防护措施至关重要。在接触农药之前，请查阅材料安全数据表（MSDS），以确定所需适当的个人防护装备（PPE）。在开展任何生物测定实验之前，相关人员必须接受实验室农药操作的专项培训。

2.2 配制储备液

从杀虫剂有效成分（AI）原药配制已知浓度的储备液。生物测定中所有处理所需的浓度均需由该原始储备液稀释而成。本文以配制100 μg/ml的溶液100 ml作为储备液为例；然而，也可根据需要从该初始浓度进一步稀释成任意所需浓度。称取技术级AI的量应根据其纯度百分比进行调整。

需称取的量 = （配制体积）×（[溶液中 μg / ml] / [纯度% / 100]）

例如，要配制 100 ml 浓度为 100 μg/ml、纯度为 98.5% 的工业级杀虫剂溶液，需要 10152.284 μg 的工业级活性成分。

(100 ml) × ([100μg/ml] / 0.985) = 10152.284 μg

2.2.1 接触性杀虫剂的成虫小瓶检测

向容量瓶中加入部分丙酮，称取所需量的杀虫剂有效成分。用丙酮冲洗称量舟，并将冲洗液转移至容量瓶中，以确保称量舟上的杀虫剂全部转移。用丙酮定容至容量瓶刻度线。大多数溶液在冷藏条件下保存时，活性可维持约一个月，无明显药效损失。

2.2.2 针对系统性杀虫剂的成虫小瓶试验改良

昆虫中毒于内吸性杀虫剂的方式与接触性杀虫剂明显不同。内吸性杀虫剂通常需要被昆虫摄取后才能发挥作用，而不是像接触性杀虫剂那样通过昆虫直接接触药剂起效。因此，成虫小瓶试验经过修改，以便能够测试内吸性杀虫剂。 配制母液所需有效成分（AI）的重量计算方法与第2.2节所述类似。方法基本相同，唯一的区别是将有效成分溶解于按重量计10%的蜂蜜：水溶液中。该溶液应在生物测定开始前24小时内配制。如果原药材料不溶于水，可用丙酮配制成高浓度的杀虫剂溶液，从而仅需向蜂蜜：水溶液中加入少量杀虫剂：丙酮混合液即可⁴。

2.3 确定浓度范围并制备相应浓度

确定建立生物测定反应范围所需的最佳浓度可能较为困难。可能需要进行多次重复实验，通过反复试验来界定浓度范围。此外，如果种群的敏感性水平发生变化，该范围也可能随时间而改变。在确定最终浓度时，还应考虑许多其他因素，包括：昆虫的科、杀虫剂的类别、昆虫的大小等。以往发表的成虫小瓶试验结果可为杀虫剂浓度的初步选择提供参考。已有文献报道的生物测定包括：半翅目：粉虱科^5-6、蚜科⁷、蝽科^8-10和盲蝽科^11-14；缨翅目：蓟马科¹⁵；鞘翅目：长蠹科¹⁶、象甲科¹⁷、瓢虫科^18-19和圆头甲科¹⁹；双翅目：蚊科²⁰；鳞翅目：卷蛾科²¹和夜蛾科³、^22-26；膜翅目：茧蜂科^7,18、姬蜂科^26-27、蚜茧蜂科¹⁸、恩姬蜂科⁷和蚜小蜂科¹⁸。

浓度的配制基于“X” μg/ml 的溶液。然而，在为成虫小瓶试验准备小瓶时，每个小瓶仅加入 0.5 ml 溶液；因此，小瓶中的实际浓度为所配制浓度的一半。确定所需浓度后，可使用以下公式计算所需添加的溶液体积。

(C1)(V1) = (C2)(V2)
其中，C1 为储备液的浓度；V1 为配制新浓度所需储备液的体积；C2 为待配制的浓度；V2 为新浓度溶液的总体积。例如，要配制 100 ml 浓度为 5 μg/ml 的溶液，需要 5 ml 浓度为 100 μg/ml 的储备液。该 5 μg/ml 溶液将使每个小瓶的药物包被浓度为 2.5 μg/瓶。

5 ml = [(5 μg/ml) (100 ml)] / (100 μg/ml)

2.3.1 接触性杀虫剂的成虫药瓶检测

将容量瓶部分装满，加入计算好的母液量以配制所需浓度的溶液。用丙酮定容至刻度线，然后进行2.4节的操作，或用Parafilm M（Alcan Inc, Neenah, WI）密封后于冰箱中保存以备后续使用。大多数溶液可稳定保存1个月。

2.3.2 系统性杀虫剂成虫小瓶试验的改良

此步骤与之前2.3.1中所述相同，只是用10%（质量分数）的蜂蜜水溶液替代丙酮。配制足量的蜂蜜水溶液以制备所有所需浓度的溶液。这些溶液应在配制后24小时内使用。

2.4 小瓶的准备

2.4.1 接触性杀虫剂的成虫小瓶检测

若杀虫剂溶液曾存放在冰箱中，请先使其恢复至室温。丙酮的体积会随温度变化，从而影响杀虫剂的浓度。使用油漆或记号笔对20 ml玻璃小瓶（适配螺口盖）按浓度进行颜色编码。

将重复移液器调节至每份浓度分配0.5 ml。先从丙酮对照开始操作，随后依次使用最低浓度，并逐步增加浓度，直至用完所有浓度。将溶液体积约为待处理小瓶数量一半的量（例如，处理40个小瓶时取20 ml）倒入一个小烧杯中。当溶液不使用时，应盖住以减少蒸发，防止浓度发生变化。将杀虫剂溶液吸入重复移液器中，然后向各个玻璃小瓶中分别分配0.5 ml溶液。

处理后立即将玻璃小瓶置于商用热狗加热辊上。当滚轴转动时，玻璃小瓶随之旋转，丙酮随之蒸发，使药剂残留在瓶内壁形成技术级杀虫剂涂层。热量可能导致杀虫剂降解，因此必须关闭加热功能。可通过两种方式实现：对于加热和滚动由同一开关控制的型号，应断开加热元件；或选用加热元件与滚轴具有独立开关控制的热狗加热辊型号。应避免处理超过滚轴容量的小瓶数量，否则丙酮可能在玻璃小瓶完成旋转前即已蒸发，导致瓶壁涂层不均匀。

让离心管持续旋转，直至所有丙酮完全蒸发。管壁上可能残留一层细微的丙酮冷凝物，因此需要逐一检查每个离心管。离心管滚动所需时间根据实验室条件而有所不同。离心管干燥后，应盖上盖子，并在低温或避光条件下储存。已观察到昆虫停留在带有锥形衬垫或破损铝箔衬垫的管盖上，这些衬垫悬垂于管口下方（即避开处理过的表面）；因此，使用无衬垫的管盖非常重要。

未用于制备试剂瓶的剩余溶液应妥善处理。容量瓶中剩余的溶液可用帕拉膜（Parafilm）密封后置于冰箱中保存。试剂瓶制备完成后应标注日期，因为不同杀虫剂的保存期限不同。例如，拟除虫菊酯类包被的试剂瓶有效期约为一个月；而包被较不稳定杀虫剂（如有机磷类）的试剂瓶，其保存期限为两周或更短。

2.4.2 用于系统性杀虫剂的改良成虫小瓶检测法

需要使用花泥作为基质，以向昆虫递送杀虫剂溶液⁴。使用打孔器将花泥切割成 12 mm × 12 mm 的小块。将一块花泥放入前述的玻璃小瓶中。用重复移液器吸取已调节至可释放 0.5 mL 溶液的体积，将溶液滴加到花泥上。此液体体积应使花泥完全饱和，但液面不应超过小瓶中花泥的高度。同样，按照从对照组（仅含 10% 重量比的蜂蜜：水溶液）到最低浓度至最高浓度的顺序依次操作。

2.5. 储存小瓶

2.5.1 接触性杀虫剂的成虫小瓶检测

保存杀虫剂包被的小瓶时，需了解该杀虫剂的性质。不同杀虫剂具有不同的储存要求：例如，拟除虫菊酯类对光敏感，可在室温下避光保存；而有机磷类杀虫剂对温度敏感，需在冷冻条件下储存。若杀虫剂需冷冻保存，则在接触昆虫前必须将其恢复至室温。

2.6 生物测定

收集待测昆虫。此过程可使用信息素诱捕器、扫网或其他大规模捕获方法进行。昆虫捕获后应饲养8-24小时，以使在采集过程中受伤的个体发生自然死亡；在此期间应为其提供食物和水分来源。每个浓度测试10-25只昆虫（至少10只）；测试的昆虫数量越多，所得数据集越可靠。在为生物测定选择昆虫时，应挑选健康、活跃的个体，剔除迟钝或异常的个体。将昆虫放入小瓶时，应使其暴露于全部浓度范围内，而非仅暴露于单一浓度。该操作可避免将最健康和最活跃的个体集中分配至一个或少数几个浓度中。此外，若无法保证每个浓度至少10只昆虫，应尽可能多地使每个浓度暴露于昆虫。随后在短时间内（两至三周内）从同一采样区域再次采集更多昆虫，并重复实验。某些昆虫随着作物生长季的推进可能降低敏感性（产生抗性）；因此，早春采集个体的反应可能与秋季采集个体的反应不同²⁸。

制定评估死亡率的标准。最常用于将昆虫归类为濒死或死亡的标准是缺乏协调性运动。这些观察指标可能包括：当昆虫被置于背面向上的位置时无法自行翻转至正常体位，无法持续进行1米的协调飞行，或在用钝器轻柔触碰时缺乏协调性运动。如果个体虽能尝试翻转但随即倾倒，则视为无协调性运动，应判定为死亡。昆虫在光滑表面上可能难以完成翻转动作；因此，可能需要为其提供一个表面，使其能够获得足够的摩擦力以完成翻转。记录每个浓度下的存活个体数和死亡个体数，用于计算各浓度下的存活率。

2.6.1 接触性杀虫剂的成虫药瓶测试

将昆虫放入小瓶中，并将瓶盖轻轻拧紧。瓶盖需能够防止昆虫逃逸，同时留有足够间隙以保证空气流通。在大多数昆虫生物测定实验中，每个小瓶仅放入一只昆虫；然而，对于体型较小的昆虫（例如粉虱或蓟马），每瓶可放入多达30只个体^{6, 15}。将小瓶直立放置于室温条件下，直至在生物测定实验的终点对昆虫死亡率进行评估。暴露时间可能因昆虫种类及所用杀虫剂的不同而有所差异^3,5-27。在使用新的昆虫或化学药剂初步确定毒性水平时，应在暴露后的多个预定时间点对实验对象进行观察。当最高浓度组死亡率达到100%，且未使用杀虫剂的对照组仍保持较高存活率（死亡率<10%）时，可终止观察。若在最高浓度下未能达到100%死亡率，而对照组存活率仍较高，则应重复实验，采用更高浓度的药剂梯度。理想情况下，随着杀虫剂浓度的增加，死亡率应相应上升。

某些昆虫在暴露24小时的情况下，需要水分来源（例如一小片植物材料）¹²。在对脆弱昆虫进行成虫药瓶试验前，有必要先确定其在无水分来源的药瓶中可存活的时间。该信息可通过将昆虫分别置于有或无水分来源的药瓶中，并在实际杀虫剂试验前监测其随时间的存活情况来获得。

2.6.2 系统性杀虫剂的改良成虫小瓶检测法

在开始生物测定之前，需确定昆虫能否在仅浸有蜂蜜:水溶液的花泥上取食并存活，且不接触杀虫剂。将昆虫放入含有仅浸有蜂蜜:水溶液（或在配制非水溶性原药杀虫剂时所用最大丙酮体积的蜂蜜:水溶液）的花泥小瓶中，连续数天监测其存活情况。这种成虫小瓶试验的改良方法目前仅在Miridae⁴和Pentatomidae²⁹中进行过研究；因此，确定试验持续时间所需的实验工作量大于接触性杀虫剂生物测定。例如，Lygus lineolaris（Palisot de Beauvois）在暴露于噻虫嗪后24小时评估死亡率，而暴露于吡虫啉时则在72小时评估⁴。当Oebalus pugax F. 暴露于呋虫胺时，死亡率在96小时进行评估²⁹。因此，在能够准确评估由杀虫剂中毒引起的死亡率之前，对照组小瓶中的昆虫存活率必须在连续数天内保持较高水平。

将昆虫放入含有饱和花泥的闪烁瓶中。不要用瓶盖密封，而是用棉球密封瓶口。将瓶子直立放置于室温下，直至对昆虫的死亡率进行评估。如前所述，应定期评估死亡率。当最高浓度组达到100%死亡率，而对照组存活率较高（死亡率<10%）时，可终止观察。必要时可测试更多浓度梯度。

2.6.3 数据分析

根据 Abbott 的公式³⁰ 对对照处理中的死亡率进行校正。

校正死亡率 (%) = ((对照组存活率 - 处理组存活率) / 对照组存活率) × 100

使用对数剂量-概率法（Log Dose probit）分析数据，以确定杀死 50% 种群个体所需的致死浓度（LC₅₀），并建立 95% 置信区间（CL）。可使用多种软件程序计算 LC₅₀（SAS：PROC PROBIT ³¹，Polo-Plus ³²）。

3. 注意事项

1. 在负压通风橱中操作丙酮和杀虫剂。
2. 使用容量瓶时，最好准备两个装有丙酮的洗瓶。一个洗瓶应改装为可快速释放液体，另一个则用于缓慢释放。可通过移除部分导流管以增大开口，使该洗瓶能够快速加入大量液体。当丙酮液面接近刻度线时，更换为释放速度较慢的洗瓶，以便更精确地控制加入的液体量。若液面超过刻度线，可打开瓶塞，让丙酮自然蒸发至刻度线处。
3. 注意配制所需浓度时需使用的储备液量，即，当你填充烧瓶时 ¾ 但需要加入30毫升时，可能会超过量程刻度线。

讨论

LC₅₀ 值可用于建立目标种群的基线敏感性。该数据可用于未来的监测调查，或直接用于将当前结果与先前确定的 LC₅₀ 值进行比较，以判断目标种群的敏感性是否发生变化。可通过比较 95% 置信区间来在不同种群之间比较实际的 LC₅₀ 值；如果上下限不重叠，则表明该种群的敏感性可能已发生显著变化，在某些情况下提示已产生抗性³³。LC₅₀ 值还可用于分析杀虫剂敏感性随季节的变化²⁸，或比较不同物种或不同杀虫剂有效成分（AI）的反应差异。已有大量研究利用这些数据比较雌雄个体之间的反应差异¹⁰，或成虫与未成熟阶段之间的反应差异^10,34。有时置信区间较宽或无法计算。为获得更窄的置信区间，应使用更多昆虫和/或更多浓度梯度进行生物测定实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50-100 ml 玻璃烧杯
带塞容量瓶（对于对光敏感的杀虫剂如拟除虫菊酯类，可使用棕色瓶）
20 ml 玻璃闪烁瓶，配无衬垫瓶盖
一种对瓶子进行颜色标记的方法（油漆或记号笔）
丙酮
商用热狗加热辊（加热元件已断开）
两个洗瓶（其中一个经过改装，瓶口较大，便于快速倾倒液体；另一个瓶口较小，便于缓慢释放液体）
小型称量舟（确保所有塑料材料耐丙酮）
配备可读性为 0.001 g 或更高精度的天平
Parafilm M 封口膜
重复移液器
合适的吸头
可插入容量瓶的玻璃移液管
通风橱（用于去除丙酮气味）
存放杀虫剂溶液和小瓶的场所［根据化学品性质选择冰箱（用于溶液）、暗室或冷冻柜（用于小瓶）］