Electroeluting的DNA碎片

Summary

此过程允许高产纯化的DNA片段。

Abstract

在分子生物学，纯化后的DNA片段用于不同的目的，他们可以通过以下几个步骤的准备。他们大多需要以前的DNA片段的电泳以独立乐队的利益。然后，这个乐队是切除了从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶，并用纯化之一:具有约束力，从玻璃或石英颗粒，DEAE -纤维素膜，洗脱"粉碎和浸泡法"，电泳或非常往往是昂贵的商业纯化试剂盒。因此，选择一种方法，主要将取决于什么是可在实验室。电泳程序允许一个净化非常干净的DNA，在大量的应用（放射性标记，测序，限制酶，酶的修饰，克隆等）使用。这个过程包括在把DNA带含有样品井electroeluter，然后应用当前的琼脂糖或丙烯酰胺片的DNA片段离开琼脂糖，因此被困在一个缓冲盐乙醇沉淀后予以追缴。

Protocol

1. 为了得到净化的兴趣选择的D​​NA片段，这些应解决的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶，凝胶用溴化乙锭染色使用0.5X TBE缓冲液（三硼酸盐，EDTA）电泳，在120伏1小时。对于这一点，以前〜700质粒pProEx GdMre11S吴（6000 - BP）与NdeI和HindIII消化，是用来释放一个900 bp的片段（560片段的质粒和84吴吴）。
2. electroeluter坦克（图1）应填写与同样分布在高原中的每一​​侧的0.5X TBE考虑到中期高原照顾不泄漏。
3. 所选波段（或波段）的凝胶切出，并尽可能靠近V通道（片，每孔）放置在样品室。运行缓冲液应该被添加到每个分庭;只够盖的凝胶片。
4. 每个通道使用，必须刷新巴斯德吸管，以消除任何气泡被困。
5. 然后10米NH ₄醋酸100 UL（方便的可视化，加入少量的溴酚蓝，刚够颜色）轻轻加入V通道内。
6. 应关闭盖子，轻轻地，以防止任何再悬浮的高盐缓冲。
7. 电泳是在100伏25分钟开始。
8. 当electrolution完成后，400 UL，从V -通道，并在离心管置于2卷，冷乙醇和糖原（建议提高DNA回收）在4 ° C沉淀1个小时或过夜。
9. 离心20分钟，去除上清液，并用70％乙醇。
10. 干管和量化外径260纳米的DNA。
11. 回收率为75％（63纳克恢复时，84纳克被放置在V -通道）。

图1，Electroeluter图。 Anod一个阴极上标明每个侧槽，切片凝胶中的DNA（作为一个黑色的方形所示）将移向阴极，由于其负电荷。然后，将被困在盐缓冲位于V型通道（作为一个倒置的黑色三角形表示）。

Discussion

运行的时间将取决于高度上的片段大小，通常为片段高达20 KB 50分钟到1小时就足够了，而小碎片的监测，每10分钟的紫外灯是需要防止的片段，经过盐垫，从而减少恢复正极缓冲室。重要的是要确保，当您设定在100伏的电源，是目前至少有10 MAMP。 DNA条带，使用的紫外线灯，可以监测和检测时放弃的凝胶片。坐垫也可以带3米的钠醋酸盐。

此过程允许将放射性恢复良好（〜80％）的大小不同的DNA或RNA片段的纯化，限制性内切酶消化，加工修饰酶，等

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NdeI	New England Biolabs	R0111L
HindIII	New England Biolabs	R0104L
NH4 醋酸酯	JT Baker	0596
琼脂糖	Invitrogen	15510-027
生物光度计	Eppendorf	6131 000 020
Electr–卢特	IBI	UEA CAT 46000