该实验步骤可实现高得率的DNA片段纯化。
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摘要
摘要
纯化的DNA片段在分子生物学中有多种用途，可通过多种方法制备。大多数方法需要先对DNA片段进行电泳，以分离出目标条带。随后，将该条带从琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中切下，并通过以下方法之一进行纯化：玻璃或二氧化硅颗粒的结合与洗脱、二乙氨基乙基（DEAE）-纤维素膜、"压碎浸泡法"、电洗脱，或通常较为昂贵的商业纯化试剂盒。因此，方法的选择主要取决于实验室现有的条件。电洗脱法能够获得非常纯净的DNA，适用于多种下游应用（如测序、放射性标记、酶切、酶学修饰、克隆等）。该方法的原理是将含有DNA条带的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶切片放入电洗脱装置的样品孔中，施加电流后，DNA片段会从凝胶中迁移出来，并被捕获于缓冲盐层中，随后可通过乙醇沉淀回收DNA。
方案
- 为了选择需要纯化的目标DNA片段，应将样品在含有溴化乙锭的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离，电泳条件为使用0.5×TBE缓冲液（Tris硼酸盐，EDTA），120伏电压，运行1小时。实验中使用约700 ng经NdeI和HindIII酶切后的pProEx-GdMre11S质粒（6000 bp），以释放一个900 bp的片段（质粒部分为560 ng，片段部分为84 ng）。
- 电泳洗脱槽（图1）应加入0.5×TBE缓冲液，使两侧中段平台的液体量相等，注意避免将缓冲液溅至中段平台。
- 将选定的条带（或条带）从凝胶中切下，放入加样孔中，尽可能靠近V通道（每孔放置一片）。每个样品室中应加入电泳缓冲液，用量以刚好覆盖凝胶条带为宜。
- 每次使用的V通道必须用巴斯德移液管冲洗，以清除任何滞留的气泡。
- 然后加入100 μl 10 M NH₄OH4 乙酸盐（为便于观察，加入少量溴酚蓝，仅需足以染色即可）被轻轻加入V形通道内。
- 应轻柔地关闭盖子，以防止高盐缓冲层重新悬浮。
- 电洗脱以100伏电压开始，持续25分钟。
- 电洗脱完成后，从V型槽中取出400 μl，转移至微量离心管中，加入两倍体积的冷乙醇和糖原（建议添加以提高DNA回收率）进行沉淀。 4 ° C 1小时或过夜。
- 离心20分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤。
- 干燥管并用OD 260 nm定量DNA。
- 回收率为75%（在V型通道上加入84 ng时回收到63 ng）。
图1. 电洗脱装置示意图。电泳槽两侧分别标示出阳极和阴极，含有DNA的凝胶切片（图中以黑色方块表示）因其带负电荷而向阴极迁移，随后被截留在位于V型槽中的盐垫层（图中以倒置的黑色三角形表示）内。
讨论
运行时间在很大程度上取决于片段的大小，通常对于不超过 20 kb 的片段，50 分钟至 1 小时已足够；而对于较小的片段，则需每 10 分钟用紫外光监测一次，以防止片段穿过盐垫层进而进入阳极缓冲室，导致回收率降低。必须确保当电源设置为 100 伏时，电流至少达到 10 mA。可通过使用紫外手持灯观察 DNA 条带，检测其何时离开凝胶切片。盐垫层也可使用 3 M 醋酸钠配制。
该方法可纯化不同大小的 DNA 或 RNA 片段，回收率较高（约 80%），所得片段可用于放射性标记、限制性内切酶消化、修饰酶处理等后续操作。
致谢
Bermudez 博士实验室的工作由 Conacyt（资助号 #82622）提供资金支持。我们感谢 Gabriela Gutierrez-Sosa、Eliuth Reyes-Martinez 和 Ximena Rodriguez-Torres 为电洗脱步骤的视频录制工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 乙酸盐 | JT Baker | 0596 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 15510-027 | |
| 分光光度计 | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| 电泳–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
参考文献
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
重印与许可
