运动学与地面反作用力测定：量化青年、中年和老年大鼠运动能力的示范实验

摘要

在神经科学和骨科等领域的多种疾病模型中，运动常被作为行为学结果进行研究。本文旨在介绍一种在大鼠自由运动过程中采集地面反作用力和运动学数据的方法。

摘要

行为在最广泛的定义下，可被定义为生理过程的运动表现。因此，所有行为均通过运动系统表现出来。在神经科学和骨科领域，对于多种疾病模型而言，运动行为是一种常被评估的行为。例如，神经系统遭受创伤性损伤后的运动功能恢复，是最常被评估的行为之一^1-3。尽管运动行为可通过多种终点指标进行评估（如完成某项运动任务所需的时间等），也可采用半定量的运动学指标（如等级评分量表（例如Basso Beattie和Bresnahan运动功能评分量表，BBB评分量表）等）以及行为的替代性指标（如肌肉力量、神经传导速度等）进行评估，但只有动力学（力的测量）和运动学（身体节段在空间中的测量）能够详细描述动物实现运动所采用的策略¹。尽管对运动中的啮齿类动物进行运动学和动力学测量并非新技术，但由于专为此目的设计的商用设备日益普及，这些测量如今更容易实现。然而重要的是，研究者在开展这一相对劳动密集型的研究之前，必须充分熟悉生物力学分析的理论，并了解这些分析方法的优势与局限性。本文旨在描述一种利用商用设备采集运动学和地面反作用力数据的方法。文中详细介绍了设备与装置的设置、动物的预训练、可接受运行数据的纳入与排除标准以及数据采集方法。我们通过描述品系匹配的年轻成年、中年和老年大鼠的运动学与动力学特征，展示了该行为分析技术的应用价值。

方案

1. 生物力学运动分析的先决条件

在购买昂贵的运动分析设备以及规划将进行运动学和/或动力学运动评估的实验之前，实验人员必须熟悉生物力学分析、感觉运动行为、动物操作条件反射以及大量数字化数据的处理、存储与管理等方面的技术与实践知识。尽管这些先决条件对许多人而言看似显而易见，但只有在开展此类实验后，受训人员才会真正意识到进行相对精细的运动分析所涉及的技术与实际复杂性。作者建议实验人员参加基础生物力学相关课程，熟悉或聘请掌握数据管理所需编程语言的人员，同样重要的是，应投入大量时间与实验动物进行互动、操作和共事。为深入理解神经科学中的运动分析与感觉运动行为分析，实验人员可参考若干重要文献（见^{1, 4-7}）。

2. 运动学与动力学测试装置

一种可用于采集双侧数据的运动学与动力学测试装置，由以下组件构成（详见“特定试剂与设备表”）：

• 安静且空间足够的房间（无需完全隔音，但应位于人员走动较少的区域）
• 收音机，用于提供背景“噪音”，以减少房间外部对动物造成干扰的声音
• 透明聚碳酸酯材质、封闭式、平面跑道（长 180 cm × 宽 20 cm × 高 60 cm），跑道中央设有一个方形孔洞（11 cm × 11 cm），距两端距离相等
• 一块聚碳酸酯板（10.5 cm × 10.5 cm）
• 双面透明胶带
• 3M 反光粘性胶带，用于制作皮肤标记点
• 打孔器，用于制作皮肤标记点
• 异氟烷麻醉机，用于在放置皮肤标记点前对动物进行剃毛时实施麻醉
• Cheerios 谷物圈，用于引导动物沿跑道全长移动
• AMTI HE6X6 测力台
• Vicon Motus 定制系统（软件、计算机等）
• 4 台视频摄像机（采样频率至少 60 Hz）及配套连接线缆的三脚架
• 安装在摄像机上的卤素灯 4 盏，为实验动物及反光皮肤标记点提供最佳照明条件
• 合适尺寸的校准框架或校准空间，供 Vicon Motus 系统将 x、y、z 坐标位置校准为具有实际意义的距离测量值

3. 动物训练

在采集数据之前，每只动物必须经过训练，以使其能够穿越一个表面平坦且封闭的跑道。从合适的动物供应商处接收大鼠后，应让动物在新环境中适应1周时间。在此适应期间，每天将若干玉米圈（cheerios）放入大鼠笼内。为防止肥胖并确保动物执行任务的动机，需将动物的食物摄入量限制在其维持能量需求水平。此后，实验人员需每天对每只动物进行10至15分钟的手动接触训练，持续1周。在同一时期内，将每只动物放入跑道中，跑道两端各放置玉米圈。当动物逐渐熟悉其环境后，便会开始食用玉米圈。一旦动物在跑道内表现自如并开始食用玉米圈，实验人员即需通过操作性条件反射训练，使动物为获取食物奖励而跑完全程跑道。该过程通过将1/4块玉米圈投掷至大鼠所在位置的跑道另一端来实现。当大鼠吃掉该玉米圈后，再将另一块1/4玉米圈放置于跑道的对端。此训练每日进行15至20分钟，直至大鼠能够持续地（>90% 的试验中），大鼠应以恒定速度沿跑道行进（即不出现启动、停止、探索行为，也不改变步态），并在不出现奔跑或跳跃的情况下取食 Cheerio 麦圈。大鼠应仅采用小跑步态。对动物在此任务中的过度训练可能导致其出现奔跑和跳跃步态，这些步态表明动物在高速移动 >90 cm/s。从生物力学角度来看，由于多种原因（例如前肢主导的纳入标准等），对跳跃步态和飞跑步态的解读更为困难。根据我们的经验，一旦大鼠持续采用飞跑或跳跃步态，便很难甚至无法使其在跑道中恢复小跑步态。速度 >外周或中枢神经系统损伤后，动物很少能达到90 cm/s的速度。不同品系和性别的大鼠达到成功训练所需的时间存在差异。Wistar、Lewis、Long-Evans和Sprague-Dawley品系的大鼠通常可在训练开始后2周内稳定通过跑道。 ⁸根据我们的经验，Fischer（F-344）大鼠通常需要4至6周以上的时间才能学会该任务 ⁸.

4. 关节位置标记

由于在前肢上放置皮肤标记点会引入皮肤移动伪影，导致前肢运动学分析不可靠，这一问题在具有屈曲姿势的物种（如大鼠）中尤为突出^10-13。因此，前肢的运动学研究必须采用X射线电影摄影或透视技术来实现。基于此，本文仅描述后肢关节位置标记点的放置方法。

在数据采集前至少24小时，需使用适当的吸入性麻醉剂（例如异氟烷，通过精密蒸发器调节至1.5–2%浓度）经面罩在氧气中对每只大鼠实施麻醉，并标记关键的解剖学体表标志。由于该操作过程短暂，且未使用长效麻醉药物，因此无需使用动物保温装置来维持体温。动物麻醉后，剃除后肢及背侧至髂嵴水平的毛发。随后将动物置于胸卧位，并使用坚固的泡沫填充物支撑其后肢，使其处于近似站立的姿势。在皮肤表面标记髂嵴最 cranial 部分、股骨大转子、胫骨外侧结节、跗关节，以及第5跖骨远端和外侧部位的解剖位置。^th 用无毒的永久性记号笔标记跖骨。动物从麻醉中恢复。对于时间序列研究，可能需要定期进行麻醉以剃除后肢毛发，从而便于后续反光标记物的放置（见下文）。此外，由于大鼠会通过自然的理毛行为逐渐去除标记，因此需每天重新标记先前标注的解剖学标志（使用相同的无毒记号笔）。

5. 数据记录

检查所有相机视角，以确保其位置合适且捕获相同的视野。每台相机之间的夹角应约为60-80度。视野应包含位于中央的测力台，以及足够长的跑道，以记录两个步态周期。

将校准体积放置在跑道的预设区域内。从每个摄像头捕获跑道内校准体积的单帧图像。对每根杆上沿其长度方向的所有已校准标记进行数字化处理。只有在完成令人满意的数字化误差控制后，实验人员才能继续采集运动数据。此校准步骤在数据采集前至关重要。如果校准未准确执行，或未在录制会话前立即进行校准，则所有获得的数据都将不准确且无法使用。重要的是，如果任何一个摄像头被触碰或移动，最稳妥的做法是认为需要重新进行系统的校准。

在将动物放入跑道之前，立即记录其体重，并将预先制作好的圆锥形反光皮肤标记（使用3M反光胶带，参见表格）粘贴至后肢解剖标志点上预先标记的毛毡标记处。记录动物体重可实现后续将地面反作用力归一化为体重——若需在不同组间进行比较，此步骤至关重要。此外，体重测量有助于在整个实验过程中监测动物的整体健康状况。标记放置仅需适当的动物操作技术，无需对动物实施麻醉。若反光胶带自带的黏性不足以牢固粘附于动物皮肤，可使用极少量无毒胶水（例如3M VetBond组织粘合剂）以增强标记在动物体表的附着性。标记放置于后肢后，实验人员应舒适地就位于计算机键盘附近，并手持通过Vicon Motus系统连接的事件标记器。以已校准的文件作为模板，需预先创建多个文件，通常需保存25至30个文件。每个文件应具有唯一命名，每个文件代表一次动物奔跑过程的记录。创建25至30个文件的目的是确保收集到足够数量符合纳入标准速度（即60–90 cm/s）的有效跑动记录。创建足够数量的文件后，实验人员即可开始数据采集。实验人员需通过向跑道两端投掷四分之一片Cheerios麦圈的方式引导大鼠在跑道内往返穿梭。通过精确的协调与时机把握，在大鼠开始通过跑道以及即将完成一次有效通过前，触发事件标记。初步检查粗略的地面反作用力轨迹图后，记录左肢或右肢接触测力台的情况，随后保存并关闭该文件。应记录相等数量的左肢和右肢测力台接触数据。重复上述单次跑动的数据记录过程，直至获得足够数量的有效跑动记录。

6. 数据分析

完成运动学和地面反作用力的数据采集后，需要对每只动物的每次奔跑进行速度评估。通过两个相对固定的标记点（例如髂骨翼），可评估这两个标记点之间的虚拟点（在创建Vicon Motus文件模板时已预先设定）。在计算该“虚拟”点速度之前，必须先对髂骨标记点进行数字化处理。利用Vicon Motus软件，计算该虚拟点在X方向（运动的水平方向）上的速度。在此过程中，仅保留速度在特定范围内的奔跑数据（由预设范围确定） 先验的在最终分析中使用这些数据。我们发现，以 60–90 cm/s 速度运动的动物采用稳定的 trotting 步态。每只动物至少需要 10 次有效跑动（其中 5 次为左肢接触测力台，5 次为右肢接触测力台）。一旦确定了每只动物的合格跑动，必须完成其余皮肤标记点的数字化处理。

为了补偿膝关节处皮肤运动带来的伪影，可通过三角测量法（二维运动学中为两个圆的交点，或三维运动学中为两个球体的交点）来计算膝关节位置，方法如先前所述。目前可确定髋关节、膝关节和踝关节的角度、角速度及角加速度。站立相和摆动相的时间也可进行评估，但其准确性受限于所用摄像机的采样速度。这些及其他计算可直接使用 Vicon Motus KineCalc 软件完成（即无需导出数据），也可将数据导出为 ASCII 格式，并利用 MatLab 等软件中的自定义程序进行分析。

地面反作用力数据由AMTI测力台测量并放大，并通过Vicon Motus以1200 Hz的频率采集。因此，在采集地面反作用力数据后，使用Vicon Motus对数据应用适当的数字滤波器。鉴于实验者在数字化适当的皮肤标记点后，已经确定了运动速度并识别出可接受的有效试验，则可同时采集与运动学数据同步的地面反作用力数据，并直接通过Vicon Motus KineCalc进行分析，或借助其他可自定义的软件程序间接分析。可在三个正交方向上分别计算多种力的相关变量，例如峰值力、曲线下的面积（即冲量）等。然而，重要的是，实验者必须将每只动物每次试验的左右肢体数据分别保存。从左右肢体提取的数据分别对每只动物取平均值，并作为该动物的代表性数据。随后使用适当的统计方法对数据进行分析。

7. 代表性结果

为了展示这种运动分析方法的实用性，测定了年轻、中年和老年雌性Wistar大鼠的运动学参数和地面反作用力。通过该分析，发现了雌性Wistar大鼠在不同年龄阶段之间的差异。特别是地面反作用力分析表明，老年大鼠前肢的制动能力下降，并且相较于其他组别的动物更倾向于使用后肢进行侧向稳定（图1）。运动学分析未显示各组之间存在统计学显著差异，但结果表明，几乎任意年龄的大鼠均可顺利记录其运动学数据（图2）。

图1. 来自年轻（4月龄；n=7）、中年（13-14月龄；n=7）和老年（24月龄；n=5）雌性Wistar大鼠左肢的地面反作用力轨迹。右肢情况相似。显而易见，与年轻和中年大鼠相比，老年大鼠前肢用于制动的作用较小（* = p<0.05），且与年轻大鼠相比，老年大鼠后肢更多地用于侧向稳定（**）。实线代表均值，虚线代表均值 + 标准误（SE）；短划线代表均值 - 标准误（SE）。请点击此处查看高清图像。

图2. 年轻、中年和老年大鼠左肢的运动学简图。简图表示各组左肢在步态周期中的平均运动情况。在步态周期中，各组动物的关节角度之间无显著差异。请点击此处查看更清晰的图像。

讨论

本文提供了利用连续定量运动学和地面反作用力测定来评估运动功能的方法。对于有意采用该方法的研究人员而言，必须具备运动生物力学、动物感觉运动行为以及数据管理与处理方面的扎实背景。尽管与某些其他运动分析方法（如终点指标、序数评分量表）相比，运动学和地面反作用力测定需要更多的时间和专业知识，但所获得的数据具有高度敏感性、客观性和定量性，适用于多种物种的各类骨科^14-22和神经科^{1-3, 23-32}疾病模型。

我们提供了描述同品系不同年龄大鼠在运动功能上差异的数据，这些信息无法通过简单且敏感性较低的测量方法获得。此外，运动学与动力学分析已被用于描述多种神经系统疾病状态下的运动功能改变，而在这些情况下，其他评估方法往往难以奏效。^{8, 23-25, 27} 在评估各种疾病模型的潜在治疗剂时，采用敏感性高的检测指标尤为重要。如果检测方法的敏感性不足以识别潜在治疗剂的效果，实验者将面临犯第二类统计错误的风险（即错误地得出治疗无效的结论，而实际上治疗是有效的）。此外，由于终点指标以及评估运动功能的较为主观的测试存在引入偏倚的可能，因此在客观性方面存在局限。相比之下，运动学与动力学评估具有完全的客观性，前提是已制定了恰当的纳入与排除标准。 先验的实验者只需收集数据、进行检验并应用适当的统计方法（即数据判定中不存在主观成分）。

运动学和动力学分析还具有适用于多种物种的优势。事实上，运动学、地面反作用力测定或二者联合已应用于多种物种，包括大象^33-35、牛³⁶、马^37-40、狗^{4, 41-45}、猫^{21, 46-49}、多种啮齿类动物^{3, 8, 50, 51}、鸟类^{4, 52-55}和鱼类^{56, 57}（此列表并非详尽）。然而，根据作者的经验，小鼠的应用存在困难，因为小鼠难以通过操作性条件反射训练使其沿跑道行走。因此，小鼠在跑动过程中无法保持相对恒定的速度，而是在穿越跑道时出现加速和减速现象。这种行为可能部分可通过让小鼠在跑步机上运动并录像记录其在跑步机上的运动过程来克服⁵⁸。如果将用于测定地面反作用力的实验装置改装为适用于跑步机使用，则由于跑步机传送带的干扰，可能仅能较容易地获得垂直方向的地面反作用力，而前后方向和内外侧方向的力测定将受到限制。

总体而言，运动学和动力学分析是一种可靠、敏感且客观的方法，可用于多种骨科和神经科疾病模型的研究。此外，所有相关设备现已可用于啮齿类动物，从而消除了不进行此类感觉运动行为分析的任何相关障碍。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型低负荷测力平台	AMTI	HE6X6	http://amti.biz/PDFDownloads/0908HE6x6.pdf
Vicon Motus	Vicon	Vicon Motus 软件	http://www.vicon.com/applications/animal.html 测力台可作为Vicon Motus系统的集成组件一并购买。
Vicon Motus KineCalc	Vicon	Vicon Motus KineCalc 软件	http://www.vicon.com/applications/animal.html 兼容 Vicon Motus 数据的专有软件，从而实现直接且可自定义的数据计算。
视频摄像机	Vicon	根据需求而定	http://www.vicon.com/applications/animal.html 至少需要4台相机，以实现大鼠运动过程中后肢运动学的双侧二维或三维成像。对于运动速度在60至90 cm/s之间的大鼠，采样频率为60 Hz的相机已足够。高速相机可识别肢体间协调性中可能具有重要意义的微小差异。
校准体积或校准框架	Vicon	自定义	http://www.vicon.com/applications/animal.html 每次采集新数据之前，或在任意相机移动后，必须购买并使用合适的校准体模来校准坐标。该校准体模的尺寸应根据所检测的视野范围确定。
反光胶带	3M	NA	可通过 3M 分销商批量购买，或根据需要从 VICON 购买 http://solutions.3m.com/zh_CN/?WT.mc_id=www.3m.com/us http://www.vicon.com/applications/animal.html
Cheerios	通用磨坊	奇巧多	http://www.cheerios.com/
组织粘合剂	3M		可通过 3M 分销商购买 http://solutions.3m.com/en_US/?WT.mc_id=www.3m.com/us