为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像
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摘要
摘要
背景：卵巢癌通常在晚期才被诊断，此时病死率较高，因此仍是美国女性中最致命的妇科恶性肿瘤1,2,3。浆液性肿瘤是卵巢癌中最常见的类型4,5，而Tg-MISIIR-TAg转基因小鼠是唯一能自发产生此类肿瘤的小鼠模型。Tg-MISIIR-TAg小鼠在苗勒管抑制物质II型受体（MISIIR）基因启动子的调控下表达SV40病毒的转化区6。目前已鉴定出其他一些表达SV40 TAg转基因的转基因小鼠品系，但这些小鼠不会发生卵巢肿瘤。非肿瘤倾向性小鼠的寿命与C57Bl/6小鼠典型寿命相当，且具有生育能力。这些小鼠可作为来自Tg-MISIIR-TAg-DR26小鼠分离的肿瘤细胞的同基因异体移植受体。
目标： 尽管肿瘤成像是可能的 7，早期检测活体小动物体内的深部肿瘤具有挑战性。为了在免疫系统完整的动物模型中开展浆液性卵巢癌的临床前研究，我们描述了一种可用于此类卵巢癌研究的同源小鼠模型，该模型允许 体内 成像，肿瘤微环境研究及肿瘤免疫反应研究。
方法： 我们首先从一只26周龄DR26 Tg-MISIIR-TAg雌性小鼠体内分离出的自发性卵巢肿瘤中建立了一株TAg阳性小鼠癌细胞系（MOV1）。随后，我们利用编码Katushka（一种来源于海葵红色荧光蛋白的远红突变体）的TurboFP635慢病毒哺乳动物载体，对MOV1细胞进行稳定转导。 Entacmaea quadricolor 激发/发射最大值位于 588/635 nm 8,9,10我们将MOV1进行原位移植Kat 在卵巢中 11,12,13,14 非肿瘤倾向的 Tg-MISIIR-TAg 雌性小鼠。肿瘤进展通过以下方式监测 体内 通过免疫组织化学分析光学成像和肿瘤微环境。
结果： 原位移植的 MOV1Kat 细胞发育为浆液性卵巢肿瘤。MOV1Kat 肿瘤可通过以下方式可视化： 体内 植入后长达三周的成像（图1）显示，其内有白细胞浸润，类似于人类卵巢癌中的观察结果 15 （图2）。
结论： 我们描述了一种适用于卵巢癌的原位模型 体内 由于Katushka在深层组织中具有高pH稳定性和光稳定性，可实现对早期肿瘤的成像。我们建议将这种新型的同源性浆液性卵巢癌模型用于 体内 肿瘤免疫反应及免疫治疗的成像研究与监测
方案
1. 细胞培养
- 进行原位注射前，将源自DR26肿瘤的MOV1Kat细胞在T175培养瓶中培养至90%汇合度。每例注射计划使用100万至500万个细胞，需准备1至2个T175培养瓶。
- 注射当天，收集细胞并使用血细胞计数板测定细胞数量。
- 确定细胞浓度后，在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
- 离心后，将细胞重悬于10微升含0.002 M EDTA的无菌PBS中，调整至每10微升含100万个细胞。
2. 术前准备
- 手术前，用3/10 cc胰岛素注射器吸取10微升含100万MOV1-Kat细胞的PBS EDTA溶液。
- 将异氟烷麻醉的小鼠转移至加热垫上，并涂抹眼膏以防止眼睛脱水。随后，立即把动物头部置入与异氟烷挥发器相连的鼻罩系统，以在整个手术过程中维持麻醉状态。
- 使用酒精棉片对注射部位消毒后，用3/10 cc胰岛素注射器皮下注射5 mg/kg的术前镇痛药酮洛芬（Ketoprofen）。
- 使用电推剪从胸腰交界处至动物尾根部，剃除小鼠背部左侧尾侧部分的毛发。涂抹脱毛膏以彻底清除残留毛发，随后用湿纸巾擦去多余脱毛膏。
- 毛发清除后，使用聚维碘酮-碘和酒精棉片对剃毛区域进行消毒，然后在切口周围铺置手术巾。
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讨论
手术与原位注射
卵巢囊内原位注射需要经过训练并具备精确性。因此
- 若手术经验不足，应先在尸体上进行练习。
- 优先选用经产雌性小鼠（生产过一至两胎），因其卵巢随时间逐渐增大，便于注射操作，并可提高存活率，相比之下未产雌性小鼠则较难操作。
- 由于小鼠卵巢囊膜体积较小，强烈建议使用可获得的最小规格针头。
体内成像
- 始终使用荧光参考物，例如装有 106 至 107 个 MOV1kat 细胞、体积为 100 μl 至 1 ml PBS 的 1.5 ml 离心管。
- 给予动物无苜蓿饮食，以降低荧光背景。
- 在进行 in vivo 成像前仔细剃除动物体毛，以减少背景信号。
意义
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 P01 AI 068730（SNC，NS）、NIH 基金项目 CA016520/TAPITMAT（NS）、Claneil 基金会的私人资助（NS），以及针对卵巢癌的 SPORE 基金项目（资助编号：P50 CA83638，资助对象为 FCCC 与宾夕法尼亚大学）和福克斯蔡斯癌症中心核心基金（P30 CA06927）（DCC）提供支持。作者感谢宾夕法尼亚大学光学/生物发光核心设施（由 E.J. Delikatny 博士负责）提供的出色技术支持，感谢宾夕法尼亚大学癌症中心干细胞与异种移植核心设施（由 G. Danet-Desnoyers 博士负责）的 Anthony Secreto 对 SNC 进行原位注射技术的培训，以及感谢宾夕法尼亚大学/OCRC 的 Denada Dangaj 在手术方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO，Life Technologies 公司 | 14040 | |
| Versene | Lonza 公司 | 17-711E | |
| 加热垫 | Deltaphase | 39 DP | |
| 聚维酮垫片 | Dynarex | 1108 | |
| 酒精棉片 | 费希尔科技公司 | 06-669-62 | |
| 人工泪液软膏 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| 酮洛芬 | Fort Dodge 动物健康公司 | ||
| 3cc/胰岛素注射器 | BD 生物科学 | 309301 | |
| Polyg 聚乙醇酸缝合线/针（3/8 19mm） | Syneture | 9612-31 | |
| 组织粘合剂 | Vetbond | 3M | |
| 兽用百克素/口服混悬液 | Hi-tech Pharmacal 公司 | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper 生命科学公司 | ||
| 异氟烷 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| 合格胎牛血清 | Invitrogen | 10437036 | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 15140 | |
| TurboFP635 哺乳动物表达载体 | Evrogen | FP721 | |
| T175 培养瓶 | cellstar | 660-190 |
参考文献
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L.,....
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