蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

摘要

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用是所有重要细胞过程的显著特征。然而，许多此类相互作用具有瞬时性或能量较弱的特点，难以通过传统的生物化学方法（如共免疫沉淀）进行鉴定与分析。在这一领域，可遗传编码的荧光蛋白（GFP、RFP等）及其重叠的荧光光谱的发现，极大地提升了我们对弱相互作用的监测能力 体内 使用荧光共振能量转移（FRET）^1-3在此，我们详细描述了使用基于FRET的邻近检测法来监测内皮细胞表面受体-受体相互作用的方法。

方案

该方案包含三个主要步骤。第一步是将目的基因克隆至哺乳动物表达载体中，使其位于CFP和/或YFP单体版本的氨基端，此部分仅作简要讨论。第二步和第三步分别为将载体DNA转染至EA.hy926内皮细胞，以及利用FRET进行共聚焦成像，下文将对此进行更详细的阐述。

1. CFP 和 YFP 嵌合受体的构建

目的受体应克隆至CFP和YFP的单体增强型版本的氨基末端。FRET的测定具有经验性，且在很大程度上依赖于跨膜区与荧光团起始位点之间连接序列的长度¹。因此，对于每一对新研究的受体，都必须尝试多种不同长度的连接序列。

1. 将目的受体克隆至含有单体 C- 或 YFP 的 pcDNA3.1 hygro^R 或 neo^R 载体的 NheI/EcoRI 位点中（该载体可从本实验室获得）。*注意：如有需要，NheI 与其他多种酶兼容，包括 SpeI 和 XbaI。
2. 将连接反应产物转化至合适的 endA1 recA 感受态细胞系（我们常规使用 Mach1），筛选含有插入片段的菌落，并通过 DNA 测序验证无突变。
3. 在确认分子克隆成功后，使用 Qiagen 或同类 DNA 试剂盒在无菌水或 TE 中制备转染级质粒 DNA。通过紫外分光光度法评估其浓度和纯度。DNA 产量通常在 100–200 μg 范围内，常规稀释为 1 μg/μL 的工作储备液。

2. EA.hy 926 细胞的转染

1. 将在完全DMEM培养基（DMEM + 10% 胎牛血清 + 青霉素/链霉素）中培养的EA.hy 926细胞⁴传代至MatTek盖玻片（No. 0）35 mm培养皿中，每皿加入2 mL培养基。从一个15 cm的完全汇合培养皿中可保守获得约15个培养皿（次日汇合度约90%）。每个单独受体的表达检测准备一个培养皿，每种受体组合也各准备一个培养皿。
2. 将细胞在37°C、5% CO₂环境中孵育过夜。次日，细胞汇合度应达到约70–90%。
3. 转染当天，通过将2 μg嵌合受体载体DNA（2 μL）与8 μL Fugene6在200 μL预温的OptiMEM中混合，制备核酸脂质复合物。对于受体组合，每种受体各转染1 μg，总计2 μg（参见下文讨论）。
4. 轻柔颠倒混匀。
5. 室温继续孵育30分钟。
6. 在孵育期间，准备细胞进行转染。吸除新鲜培养基，用预温的PBS轻柔快速洗涤每个培养皿一次，然后加入2 mL不含抗生素的预温完全DMEM（DMEM + FBS）。注意避免使用青霉素和链霉素，因为在Fugene6处理期间，这些抗生素对细胞具有显著毒性。
7. 将复合物逐滴加入细胞中，在37°C、5% CO₂环境中继续孵育额外20–24小时。
8. 24小时后，小心吸除培养基，并用移液器加入含抗生素的新鲜完全DMEM。转染后，细胞活力应保持相对较高，即几乎无漂浮细胞可见。
9. 基因表达通常在转染后额外48–60小时达到峰值。然而，成像通常在24小时后即可进行。应开展时间进程实验以确定最佳基因表达时间。

3. 共聚焦成像与FRET分析

活细胞成像在配备蓝色二极管（405 nm）、氩离子（458、476、488、514 nm）、绿色 HeNe（543 nm）、橙色 HeNe（594 nm）和红色 HeNe（633 nm）激光器的 Leica TCS-SP2 AOBS 共聚焦激光扫描显微镜上进行，使用 HCX PI Apo 63x/1.3 n.a. 甘油浸润物镜、电动 XY 载物台（Märzhäuser）以及环境可控（温度、湿度和 CO₂）的载物台培养箱（PeCon）。实验对照至关重要，用于消除发射通道之间的荧光探针串扰，并评估表达问题及非特异性荧光探针多聚化现象。因此，每次成像实验均需使用单一荧光探针转染样本进行设置。还需进行负性 FRET 对照实验（使用已知不相互作用的受体），以确定因过表达引起的背景 FRET 水平。

1. 为消除CFP与YFP发射通道之间的串扰，将CFP表达对照样本放入载物台培养箱中。使用白光调节Z轴平面，使细胞处于聚焦状态。
2. 设置CFP发射检测的光谱窗口为465–505 nm，YFP为525–600 nm。
3. 在同时监测两个发射通道的情况下，以458 nm激发CFP。通过声光可调滤光器（AOTF）调节激光功率，以消除CFP在YFP发射通道中明显的信号渗漏。保存此设置。
4. 对仅表达YFP的细胞，使用YFP表达对照样本，在CFP通道中进行相同的对照实验：在514 nm下调节激发光功率，以控制YFP对CFP通道的串扰。保存此设置。
5. 随后将共表达CFP和YFP的细胞放入载物台培养箱中。利用Leica共聚焦软件的序列设置功能，寻找CFP和YFP表达水平相近且在细胞膜上正确分布的细胞。
6. 使用Leica软件的受体光漂白程序，将供体和受体参数分别设置为先前保存的CFP和YFP设置。
7. 放大目标细胞，在细胞膜上选择一个感兴趣区域（ROI），作为YFP光破坏的发生位置，并启动程序。
8. 为实现受体的光破坏，将AOTF在514 nm处调节至100%功率，并持续激光漂白，直至YFP发射信号减少70%。为加快漂白过程，通常将ROI选在激光扫描的光栅方向（X轴方向）。
9. 在光漂白过程中，监测细胞的移动情况，若在XY平面上出现明显移动，则应舍弃该次测量结果，因为此类数据可能导致错误的FRET效率计算。
10. 分别记录光漂白前后供体（CFP）和受体（YFP）的图像，FRET效率按以下公式计算：FRET_Eff = (D_post - D_pre) / D_post，适用于所有D_post > D_pre的情况，其中D_pre和D_post分别为光漂白前后供体的荧光强度。
11. 使用JMP软件（SAS）分析实验数据的变异性程度。

4. 典型结果

转染效率通常在30%至40%之间。尽管先前有其他研究报道过一种载体的转染和表达会促进另一种载体的情况，但我们并未观察到类似现象。事实上，我们经常看到仅有一种荧光蛋白融合体表达，而另一种则不表达。典型的FRET效率因受体系统不同而有所差异。对于Tie受体系统，上皮细胞中的典型值为20–28%，内皮细胞中为19–23%。阴性对照的典型效率低于2–3%。随着操作经验的积累，实验结果的变异性将显著降低。

图 1. 转染的 EA.hy 926 细胞代表性图像。 A) EA.hy 926 细胞单层的微分干涉差（DIC）图像。B) (A) 中所示细胞的荧光图像。C) (A) 与 (B) 的叠加图像，显示转染效率约为 20–30%。

图2. EA.hy926细胞中CFP与YFP之间发生FRET的典型受体光漂白分析。 在受体光漂白前后，分别监测CFP发射通道（上图）和YFP发射通道（下两图）。光漂白实验仅限于绿色框内区域，并基于该区域计算FRET值。FRET效率以绝对范围显示，从高（红色-1.0）到低（紫色-0.0），叠加在放大后的CFP/YFP合并图像上，仅用于定位参考。

讨论

有多个步骤对实验成功至关重要。其中最突出的是两种嵌合受体之间的相对表达水平。为解决这一问题，可构建稳定共表达两种目标蛋白的细胞系，或确定载体DNA的最佳比例以实现相当的表达水平。同样，由于培养皿中转染效率不均，细胞间的蛋白表达水平通常并不一致。因此，必须注意区分“高”表达细胞与“低”表达细胞。通常，蛋白表达处于“中等”水平的细胞可产生可靠且可重复的FRET效率。本实验室为缓解该问题所采用的一种方法是使用腺病毒和慢病毒来实现更均一的基因表达。此外，除受体光漂白法外，另一种测定FRET效率的方法是敏化发射法。尽管敏化发射法具有实时监测单个细胞的潜力，但我们发现受体光漂白法更为灵敏且更可靠。

最后，利用FRET监测蛋白质相互作用具有挑战性，需要为膜结合受体仔细选择连接子长度。此外，添加C/YFP通常会显著影响蛋白质表达水平，并导致内质网和高尔基体中出现聚集。然而，对于瞬时或不稳定的相互作用，FRET是理想的研究方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	11960-069
青霉素-链霉素	Invitrogen	15070-063
胎牛血清	Hyclone	N/A
Opti-MEM	Invitrogen	11058-021
FUGENE 6	Roche Group	11814443001
盖玻片培养皿	MatTek Corp.	P35G014C
pcDNA3.1(+)	Invitrogen	V790‐20
Mach 1 感受态细胞	Invitrogen	C862003