本文介绍了一种简单的技术，可用于实现禽类胚胎的长期体外培养。ex-ovo 培养技术特别适用于需要对禽类胚胎进行全程光学观察和/或无菌转运的纵向实验研究。
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本文内容
摘要
摘要
理解驱动正常与异常胚胎发育的遗传因素和微环境因素之间的关系，对于发现新的治疗策略至关重要。成像技术的进步使得研究人员能够对体轴结构的形成与成熟过程进行定量研究，但对较晚期胚胎形态发生的理解仍不够清晰。鸡胚胎是该研究领域中一种具有吸引力的脊椎动物模型系统，因其易于培养并可进行手术操作。早期胚胎可短暂培养在滤纸环上，从而为细胞模式形成与命运追踪研究提供完整的光学通路1,2。对于心脏形态发生等较晚期发育过程的研究，传统上通过蛋壳开窗进行3-5，但该方法因窗口尺寸限制而影响光学观察。我们此前开发了一种简单的方法，可将整个胚胎在体外培养于六边形称量皿中，最长可达10天，并实现了通过超声成像进行高分辨率观察6,7。然而，此类培养系统在运输过程中存在困难，限制了活体实验中可用的成像工具类型。本文中，我们提出一种改进的无壳培养系统，配备低成本、可携带的环境控制舱。将鸡蛋打破后置于由聚氨酯膜（保鲜膜）固定在部分盛有无菌水的塑料杯边缘所形成的吊床结构上。吊床的周长和深度尺寸均至关重要，以维持必要的表面张力，而吊床本身及其下方水体的力学特性有助于缓冲运输过程中产生的振动。此外，我们还开发了一种小型循环水浴装置，可在实验过程中实现持续的温度控制。我们证明，利用该系统可成功培养胚胎至少14天，且不出现形态发生缺陷或发育延迟，并已将该系统应用于多种显微手术与成像实验中。
方案
1. 体外培养 培养方案：
- 孵育受精鸡卵
- 受精鸡卵可在13°C下储存最多5天而不启动发育。红酒冷却器可维持此温度。
- 将鸡卵钝端朝上置于37.5°C、60%恒定湿度的培养箱中，持续摇动培养72小时。
- 制备吊床（图1a）
- 用温热的无菌水填充9盎司塑料杯的3/4。标准9盎司杯的顶部直径为8 cm。我们发现此尺寸最适合本文所述的长期培养应用。
- 剪取约20 cm保鲜膜，用橡皮筋将其沿杯口周向固定。塑料膜应平铺于水面上。剪去橡皮筋周围多余的塑料膜。我们发现保鲜膜最适合此用途，因其可防止卵黄粘连，避免在运输过程中卵黄破裂。
- 用浸有70%乙醇的无尘纸（Kimberly-Clark, Inc.）擦拭塑料膜表面。
- 在孵育72小时后将鸡卵从培养箱中取出。
- 用浸有70%乙醇的无尘纸擦拭卵壳表面，对鸡卵进行消毒。
- 将鸡卵水平放置1–2分钟，使胚胎正确定位（图1b）。可使用鸡蛋托盘水平放置鸡卵。1–2分钟后，胚胎将旋转至上方位置。
- 在超净工作台内无菌操作将胚胎转移至吊床上。
- 使用锋利边缘（如金属桶边....
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讨论
由于蛋壳的限制，在禽类胚胎中进行光学观察和实验操作具有挑战性。开窗法显著限制了可用于注射和显微外科操作的微血管数量8。因此，仅能对早期胚胎进行操作，且无法实现连续观察。早期采用培养皿进行的体外（ex-ovo）培养应用受限，因为胚胎表面张力难以有效控制，导致无法长期培养9。我们近期通过使用六边形称量皿改进了该技术，可维持适宜的表面张力7，但此类培养体系在运输过程中仍存在困难。本文所介绍的技术解决了这一问题，并显著拓展了可应用的实验方法和成像技术类型，包括显微注射和外科手术操作。随着研究重点转向对后期形态发生事件的理解，该技术将有助于对目前难以持续进行实验研究的发育过程进行监测与调控。
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 可育的白来航鸡鸡蛋 | |||
| Model GB1，Avery Incubators，Hugo CO | |||
| 保鲜膜 | |||
| Kimwipes 纸巾 | Kimberly-Clark Corporation | ||
| 橡胶圈 | |||
| 温热的无菌水 | |||
| 9 盎司塑料杯 | |||
| 直径 100 mm 的培养皿 | |||
| 1602N 热风循环装置 | GQF Manufacturing | ||
| 荧光素标记的葡聚糖（2 MDa，磷酸盐缓冲液中 1% w/v） | Sigma-Aldrich | ||
| 显微玻璃针拉制仪 | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| 玻璃毛细管（内径 0.75 mm） | |||
| 显微操作器 | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| 荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| 精细 55 号镊子 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 尼龙外科缝合线 | Ethicon Inc. | ||
| 管路 | VWR international | 外径 1 mm | |
| 3 mL 注射器 | BD Biosciences | ||
| 200 μL 移液器及吸头 | VWR international |
参考文献
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E.
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