一种适用于成像与显微手术应用的ex-ovo鸡胚培养系统

摘要

本文介绍了一种简单的技术，可用于实现禽类胚胎的长期体外培养。ex-ovo 培养技术特别适用于需要对禽类胚胎进行全程光学观察和/或无菌转运的纵向实验研究。

摘要

理解驱动正常与异常胚胎发育的遗传因素和微环境因素之间的关系，对于发现新的治疗策略至关重要。成像技术的进步使得研究人员能够对体轴结构的形成与成熟过程进行定量研究，但对较晚期胚胎形态发生的理解仍不够清晰。鸡胚胎是该研究领域中一种具有吸引力的脊椎动物模型系统，因其易于培养并可进行手术操作。早期胚胎可短暂培养在滤纸环上，从而为细胞模式形成与命运追踪研究提供完整的光学通路^1,2。对于心脏形态发生等较晚期发育过程的研究，传统上通过蛋壳开窗进行^3-5，但该方法因窗口尺寸限制而影响光学观察。我们此前开发了一种简单的方法，可将整个胚胎在体外培养于六边形称量皿中，最长可达10天，并实现了通过超声成像进行高分辨率观察^6,7。然而，此类培养系统在运输过程中存在困难，限制了活体实验中可用的成像工具类型。本文中，我们提出一种改进的无壳培养系统，配备低成本、可携带的环境控制舱。将鸡蛋打破后置于由聚氨酯膜（保鲜膜）固定在部分盛有无菌水的塑料杯边缘所形成的吊床结构上。吊床的周长和深度尺寸均至关重要，以维持必要的表面张力，而吊床本身及其下方水体的力学特性有助于缓冲运输过程中产生的振动。此外，我们还开发了一种小型循环水浴装置，可在实验过程中实现持续的温度控制。我们证明，利用该系统可成功培养胚胎至少14天，且不出现形态发生缺陷或发育延迟，并已将该系统应用于多种显微手术与成像实验中。

方案

1. 体外培养 培养方案：

1. 孵育受精鸡卵
   1. 受精鸡卵可在13°C下储存最多5天而不启动发育。红酒冷却器可维持此温度。
   2. 将鸡卵钝端朝上置于37.5°C、60%恒定湿度的培养箱中，持续摇动培养72小时。
2. 制备吊床（图1a）
   1. 用温热的无菌水填充9盎司塑料杯的3/4。标准9盎司杯的顶部直径为8 cm。我们发现此尺寸最适合本文所述的长期培养应用。
   2. 剪取约20 cm保鲜膜，用橡皮筋将其沿杯口周向固定。塑料膜应平铺于水面上。剪去橡皮筋周围多余的塑料膜。我们发现保鲜膜最适合此用途，因其可防止卵黄粘连，避免在运输过程中卵黄破裂。
   3. 用浸有70%乙醇的无尘纸（Kimberly-Clark, Inc.）擦拭塑料膜表面。
3. 在孵育72小时后将鸡卵从培养箱中取出。
4. 用浸有70%乙醇的无尘纸擦拭卵壳表面，对鸡卵进行消毒。
5. 将鸡卵水平放置1–2分钟，使胚胎正确定位（图1b）。可使用鸡蛋托盘水平放置鸡卵。1–2分钟后，胚胎将旋转至上方位置。
6. 在超净工作台内无菌操作将胚胎转移至吊床上。
   1. 使用锋利边缘（如金属桶边缘或玻璃烧杯边缘）轻轻敲击鸡卵，直至卵壳底部出现小凹痕（图1c）。请注意，胚胎位于上方位置。
   2. 将两个拇指置于凹痕两侧，水平拉开卵壳（图1d）。
   3. 将带有胚胎的卵黄及蛋清一同置于吊床上（图1e）。蛋清可在卵黄周围提供缓冲环境，吸收系统移动时产生的震动，同时为长期培养中的胚胎提供营养。吊床下方的水可确保胚胎在运输过程中保持与地面平行，并在使用水循环加热器成像时作为热传导介质。
   4. 若操作正确，胚胎应已位于上方位置。若未到位，可使用无锐角的无菌物体（例如闭合的弯头剪刀的钝端）轻柔地定向抚触卵黄，使胚胎旋转至顶部。
   5. 将一个直径为10 cm的培养皿盖在杯口，以密封胚胎。
7. 将杯式培养物放入设定为37.5°C的培养箱中。若使用便携式培养箱，可在其中放置1–2个装有蒸馏水的9盎司杯，以维持约60%的湿度（图1f）。
8. 若需将胚胎培养至孵化第7天以后，应在胚胎周围散布碎蛋壳碎片，作为骨骼发育和成熟所需的钙源。

体外培养箱成像/操作的辅助设备：

自制了一个循环水浴装置，用于在成像或操作过程中维持孵育温度（图3）。一个可容纳样品杯的水浴槽通过适当尺寸的管路连接至储水容器。储水容器中的水由电阻加热器加热，并通过监测水温进行手动调节。水泵用于循环水流。图示展示了通过超声成像/荧光显微镜进行成像的便捷性（图3）。

图1. 吊床的制备及鸡胚向吊床的转移。

图 2. 代表性结果——通过体外（ex ovo）培养技术培育的不同发育阶段的鸡胚。 HH 17 期及以后的胚胎可通过该技术进行培养。

图3. 与之联用的水循环系统的示意图及代表性图片 体外培养 用于将胚胎维持在理想发育温度的培养系统。

2. 选定的应用：

一、显微注射

该胚胎培养方法适用于需要将溶液注射至血管系统以进行基于对比度成像（例如荧光显微镜、微型计算机断层扫描等）的显微注射应用（图4）。以下是显微注射方案：

1. 准备注射装置
   1. 使用微加工仪将外径0.75的玻璃毛细管拉制成斜面尖端的微针。尖端尺寸的选择取决于目标静脉的直径和所需的流速。
   2. 将注射器连接到内径为0.03英寸的硅胶管上。
   3. 将待注射溶液装入管路，并将微针连接至管路。
   4. 将微针放置在显微操作器上，并将注射器固定于注射器支架或注射泵中。
2. 在杯中加入无菌水，使胚胎上浮。我们发现，为了使针头准确刺入血管（如卵黄静脉），必须进行水平穿刺。这要求胚胎与杯缘处于同一水平面。
   1. 取出固定在胚胎下方塑料片上的橡皮筋。
   2. 轻轻抬起塑料杯的一侧，向杯中加入一些无菌水。
   3. 再次将橡皮筋固定在塑料片上。
3. 将溶液注入胚胎血管。根据我们的经验，当将溶液注入卵黄囊血管时，微针的尺寸需约为1/10^th 保持有效的灌注同时避免出血的血管直径。
   1. 将溶液泵入微针，确保不产生气泡。
   2. 将微针尖端对准选定的血管。对于卵黄囊血管，选择分叉区域可获得最大的穿刺面积。
   3. 将针头推向血管。血管会首先发生回缩。一旦针头刺入血管，开始灌注。随着灌注进行，流动血液的颜色应发生变化。如果未观察到颜色变化，可能是针头已穿出血管。此时，应缓慢回撤微针，同时持续泵入溶液，直至观察到血管内出现颜色变化。灌注完成后，将微针从血管中完全撤出。

图4：将荧光染料显微注射至血管系统中 体外培养 培养的鸡胚

二、显微外科手术——左心房结扎

这种ex-ovo培养体系非常适合对鸡胚进行外科操作，因为它能够完全暴露胚胎。以下是示例技术——左心房结扎术（LAL）（图5）的操作方案。该操作在培养开始后约24小时（HH24）进行：

1. 使用10-0尼龙外科缝线制备直径约0.5 mm的单结。
2. 用精细镊子局部去除覆盖胚胎的绒毛膜和尿囊膜，并从胚胎背部将其轻轻提起，使其垂直旋转，使胚胎左侧朝上可见。
3. 用精细镊子去除左心房上方的心包膜。
4. 将结对准左心房位置并收紧，结扎程度应使左侧血流减少约75%。用显微剪刀剪去结的线头，并小心移除并丢弃多余的缝线。
5. 将胚胎旋转回原始方向（右侧朝上）。
6. 假手术对照组将接受相同操作步骤，但缝线仅穿过而不打结。术后24小时确认左心房结扎效果（75%狭窄），不符合标准的胚胎将被剔除。

图5：对照组与左心房结扎的鸡胚。 箭头指示左心房，在结扎胚胎中其大小约减少75%。

讨论

由于蛋壳的限制，在禽类胚胎中进行光学观察和实验操作具有挑战性。开窗法显著限制了可用于注射和显微外科操作的微血管数量⁸。因此，仅能对早期胚胎进行操作，且无法实现连续观察。早期采用培养皿进行的体外（ex-ovo）培养应用受限，因为胚胎表面张力难以有效控制，导致无法长期培养⁹。我们近期通过使用六边形称量皿改进了该技术，可维持适宜的表面张力⁷，但此类培养体系在运输过程中仍存在困难。本文所介绍的技术解决了这一问题，并显著拓展了可应用的实验方法和成像技术类型，包括显微注射和外科手术操作。随着研究重点转向对后期形态发生事件的理解，该技术将有助于对目前难以持续进行实验研究的发育过程进行监测与调控。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可育的白来航鸡鸡蛋
Model GB1，Avery Incubators，Hugo CO
保鲜膜
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark Corporation
橡胶圈
温热的无菌水
9 盎司塑料杯
直径 100 mm 的培养皿
1602N 热风循环装置	GQF Manufacturing
荧光素标记的葡聚糖（2 MDa，磷酸盐缓冲液中 1% w/v）	Sigma-Aldrich
显微玻璃针拉制仪	Glassworx, Inc, St Louis MO
玻璃毛细管（内径 0.75 mm）
显微操作器	World Precision Instruments, Inc.	Model M3301L
荧光显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Z20
精细 55 号镊子	World Precision Instruments, Inc.
10-0 尼龙外科缝合线	Ethicon Inc.
管路	VWR international		外径 1 mm
3 mL 注射器	BD Biosciences
200 μL 移液器及吸头	VWR international