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瓣膜内皮细胞的分离

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DOI：

10.3791/2158

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2010年12月29日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University

本文内容

摘要

我们提供一种分离和培养纯化心脏瓣膜内皮细胞（VEC）群体的方法。VEC 可从瓣叶或小叶的任意一侧分离，随后可直接进行下方间质细胞（VIC）的分离。

摘要

心脏瓣膜负责维持心血管系统中单向血流。这些纤薄的纤维组织在其一生中需开合数十亿次，承受着显著的机械应力。这些组织之所以具有惊人的耐久性，是因为瓣膜内皮细胞（VEC）和间质细胞（VIC）能够响应局部机械和生物信号，持续进行修复与重塑。直到最近，我们才开始理解这些细胞的独特行为。 体外 实验在其中发挥了关键作用。特别是心内膜细胞（VEC）的分离与培养尤为具有挑战性。从组织离体开始直至最终接种，每一步都必须格外小心。本文提供了心内膜细胞直接分离、侧特异性分离、培养及纯化群体鉴定的实验方案。我们采用酶消化法结合轻柔的拭子刮取技术，仅获取表面细胞。这些细胞被收集至离心管中，经离心形成细胞沉淀。随后将沉淀重悬并接种于预先涂有I型胶原基质的培养瓶中。通过接触抑制性生长以及内皮特异性标志物如PECAM1（CD31）、血管性血友病因子（vWF）的表达，同时不表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），来确认心内膜细胞的表型。心内膜细胞的功能特征表现为高水平摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated LDL）。与血管内皮细胞不同，心内膜细胞具有独特的向间充质转化的能力，这一过程在胚胎瓣膜形成期间通常自然发生。1也可能在显著延长的汇合后发生 体外 培养时应谨慎操作，传代应在接近汇合时进行。内皮细胞分离后，即可轻松获得纯度较高的间质细胞群体。

方案

1. 准备

  1. 将以下物品放入带盖的器械盘中进行高压灭菌：
    1. 有齿组织镊子——用于处理瓣叶组织
    2. 组织剪刀（8 cm）——用于修剪瓣叶组织和瓣叶小叶
    3. 棉签——用于分离瓣叶或小叶的内皮层
  2. 配制无菌胶原酶溶液
    1. 将4.0克粉末状DMEM加入250 mL的18 MΩ水中。
    2. 加入1.11克碳酸氢钠。
    3. 加入（600 U/mL）180,000单位的胶原酶。
    4. 加入1%（3mL）青霉素/链霉素。
    5. 调节溶液pH至7.2。
    6. 将溶液体积定容至270 mL。
    7. 通过0.2 μm滤器过滤，对溶液进行灭菌。
    8. 加入10%（30mL）无菌胎牛血清。
  3. 配制无菌内皮细胞培养基
    1. 将6.7克粉末状DMEM加入400 mL的18 MΩ水中。
    2. 加入1.85克碳酸氢钠。
    3. 加入（50 U/mL）25,000单位肝素。
    4. 加入1%（5mL）青霉素/链霉素。
    5. 调节溶液pH至7.2。
    6. 将溶液体积定容至450 mL。
    7. 通过0.2 μm滤器过滤，对溶液进行灭菌。
    8. 加入10%（50mL）无菌胎牛血清。
  4. 配制无菌间质细胞培养基
    1. 将13.37克粉末状DMEM加入800 mL的18 MΩ水中。
    2. 加入3.7克碳酸氢钠。
    3. 加入1%（10mL）青霉素/链霉素。
    4. 调节溶液pH至7.2。
    5. 将溶液体积定容至900 mL。
    6. 通过0.2 μm滤器过滤，对溶液进行灭菌。
    7. 加入10%（100mL）无菌牛血清。

2. 心脏瓣膜瓣叶的分离

  1. 处死动物后立即无菌地切除主动脉根部。
  2. 用冷的无菌 DPBS 彻底冲洗主动脉根部以去除血液。必须尽快清除所有血液成分，以减少血管内皮细胞（VEC）死亡和细菌污染。此阶段不建议使用抗生素和抗真菌剂，因为它们可能对血管内皮细胞（VEC）有害。
  3. 直接从根部分离瓣膜小叶（每瓣膜3个），并置于含有12 mL冷DPBS的无菌15 mL锥形管中。振荡数次以去除碎片，然后更换新鲜的DPBS。
  4. 将样本置于冰上运回实验室。
  5. 到达实验室后，将装有组织的容器置于无菌操作台内。

3. 内皮层的分离

  1. 每个瓣膜（3个瓣叶）使用一个无菌35 mm培养皿，加入3 mL冷的胶原酶溶液。
  2. 将15 mL离心管中的全部三个瓣叶放入盛有胶原酶溶液的培养皿中。
  3. 在37°C条件下孵育组织5–10分钟。
  4. 用干燥的无菌拭子在瓣叶表面轻轻旋转，以去除内皮层。旋转方向和施加的剪切力大小对样本纯度至关重要。拭子的旋转方向应与手部线性运动方向相反，从而产生可控的剪切力。该剪切力可使内皮细胞从组织上脱落。施加的力度应足以感受到组织的阻力，但不得穿透基底膜。
  5. 必要时，将拭子在胶原酶溶液中轻蘸，以使细胞从拭子纤维尖端脱落。完成擦拭后，内皮层表面触感应比之前略为光滑。
  6. 收集细胞悬液/胶原酶混合液，并转移至新的无菌15 mL离心管中。
  7. 在1000 rpm条件下离心5分钟，使分离的细胞沉淀，随后吸除上清液。若同时需要分离间质细胞，则可在这些细胞离心过程中进行相应的操作。
  8. 向15 mL离心管中加入3 mL内皮细胞专用猪源培养基，再次离心后吸除培养基。第二次离心有助于去除部分不需要的物质（如纤维尖端）。
  9. 将离心后的内皮细胞重悬于5 mL内皮细胞专用猪源培养基中，并接种至预先用胶原蛋白包被的T-25培养瓶中（每管离心产物使用一个培养瓶）。
  10. 细胞接种后至少培养2–3天再更换内皮细胞培养基。由于分离过程较为剧烈，且细胞得率可能较低，此步骤有助于细胞恢复和增殖。细胞接近汇合时必须及时传代，因为接触抑制可能导致细胞发生转化。

4. 用于侧向特异性分离的 60 mm 培养皿的制备

  1. 用铝箔衬垫60 mm玻璃培养皿（每片小叶使用2个玻璃培养皿）。铝箔有助于去除石蜡，从而使玻璃培养皿可重复用于其他分离操作。
  2. 将石蜡珠放入培养皿中，约装至半满，盖上盖子进行高压灭菌。
  3. 高压灭菌完成后，石蜡熔化，将培养皿组件转移至阴凉平坦的表面。随着石蜡冷却，其会凝固形成一层可支撑针头穿刺的固体层。
  4. 30分钟后，灭菌后的培养皿即可用作固定小叶组织的分离腔室。

5. 侧特异性内皮层的分离

  1. 从15 mL离心管中取出瓣叶，放置于已准备好的60 mm培养皿中，用于特定侧面的分离。
  2. 调整瓣叶方向，使心室面朝下贴附于石蜡表面，暴露纤维面。用针固定瓣叶边缘，以暴露内皮层。
  3. 在每个朝上的内皮表面滴加数滴冷的胶原酶，将组织在37°C条件下孵育5–10分钟。
  4. 同前，用干燥无菌棉签轻轻在瓣叶表面旋转，以去除内皮层。旋转方向和施加的剪切力大小对样本纯度至关重要。棉签旋转方向应与手部线性运动方向相反，从而产生可控的剪切力。该剪切力仅使内皮细胞从组织上脱落，而不损伤其他结构。施加的力度应足以感受到组织的阻力，但不得深入组织内部。
  5. 必要时，将棉签轻蘸胶原酶溶液，以使细胞从棉签纤维尖端脱落。完成擦拭后，内皮层表面触感应比之前略为光滑。
  6. 收集细胞悬液和胶原酶，转移至新的无菌15 mL离心管中。在标签上注明瓣叶侧面信息（同一瓣膜的瓣叶可合并处理）。
  7. 将瓣叶转移至新的培养皿中，使心室面朝上暴露，重复步骤（5.3–5.6）。
  8. 待所有细胞悬液/胶原酶收集完毕后，以1000 rpm离心5分钟，使分离的细胞沉淀，随后吸除上清液。若同时进行间质细胞分离，可在本离心过程中执行相应操作步骤。
  9. 向离心管中加入3 mL内皮细胞专用猪源培养基，再次离心后吸除上清液。第二次离心有助于去除部分杂质，如棉签纤维。
  10. 将离心后的内皮细胞重悬于5 mL内皮细胞专用猪源培养基中，接种至预先包被胶原的T-25培养瓶中（每管离心产物使用一个培养瓶）。
  11. 接种后至少培养2–3天再更换内皮细胞培养基。此操作有助于细胞在经历较为剧烈的分离过程后恢复并增殖。若发现细胞得率较低，可考虑转移至更小规格的培养瓶或孔板，因细胞间黏附可促进生长。请注意在细胞接近融合时及时传代，避免接触抑制导致细胞转化。

6. 间质细胞的分离

  1. 每个瓣膜（3个瓣叶）使用一个无菌15 mL离心管，加入10 mL胶原酶溶液。
  2. 拭去瓣叶上的内皮细胞后，立即将其放入含有胶原酶溶液的相应15 mL离心管中。
  3. 孵育约12至18小时（如需要可轻轻振荡）。
  4. 用血清移液管轻轻吹打降解后的组织，直至细胞悬液与胶原酶混合均匀。此均质化过程有助于进一步破坏组织并释放间质细胞。
  5. 将消化后的组织在1000 rpm条件下离心5分钟，并吸除上清液。
  6. 向15 mL离心管中加入5 mL间质猪源性培养基，再次离心后吸除上清液。
  7. 将离心所得的内皮细胞重新悬浮于5 mL间质猪源性培养基中，并接种至T-75培养瓶中（每管使用一个培养瓶）。
  8. 接种后至少培养1–2天再更换间质细胞培养基。此过程中组织碎片会比内皮细胞培养时更多，属正常现象。由于细胞产量较高且细胞本身特性，这些细胞应比内皮细胞更快达到汇合状态。

7. 代表性图像

细胞培养对比；A）融合生长，B）稀疏生长；显微镜图像，比例尺 0.2 mm。
图1. 分离后2-3天细胞的形态。（A）VEC表现出典型的内皮细胞形态，并形成簇状以促进生长。（B）VIC的形态类似于肌成纤维细胞，通常呈 spindle 形状，并在培养瓶中均匀铺展。

细胞生长比较；显微镜图像显示密集和稀疏的细胞培养物。
图 2. 分离细胞在汇合状态下的形态。（A）VEC 表现出典型的内皮细胞形态，通常呈鹅卵石状，且生长接触抑制。（B）VIC 的形态类似于肌成纤维细胞，通常呈梭形，无生长接触抑制。

显示细胞结构的荧光显微镜图像；蛋白质定位分析。
图 3. 分离细胞的功能特征6。（A）VEC 与高水平的乙酰化低密度脂蛋白（LDL）摄取（红色）相关。（B）VIC 与低水平的乙酰化 LDL 摄取相关。

荧光显微镜图像显示细胞核（蓝色）和可能的蛋白表达（绿色）。
图4. 分离细胞的细胞标志物6。(A) 血管内皮细胞（VEC）表型表现为冯·威勒布兰德因子（Von Willebrand Factor）阳性染色（绿色），蓝色为细胞核。(B) 心内膜间质细胞（VIC）表型表现为冯·威勒布兰德因子阴性染色。

荧光显微镜下的细胞结构；A：细胞核染色，B：细胞骨架与细胞核可视化。
图 5. 分离细胞的细胞标记物。(A) VEC 表型表现为对 α-SMA（绿色）呈阴性染色，蓝色为细胞核。(B) VIC 表型表现为对 α-SMA 呈阳性染色。

解离剂解离技术细胞收集细胞数量细胞
纯度		污染
EDTA（3 mM）不含 CaCl25、20、60 分钟
在CaCl之前2 加样		采集前 20、60、120 分钟-+/-+++
EDTA（6 mM），不含 CaCl25、20、60 分钟
在CaCl之前2 添加		采集前 20、60、120 分钟+/-++++
胰蛋白酶-EDTA（0.5 g/L）5、10、15 分钟
失活前		立即收集的培养基 ++++
胶原酶 II（300 U/mL）5、10、15 分钟
失活前		立即收集的培养基-, +, ++-, ++, ++
胶原酶 II（600 U/mL）5、10、15 分钟
失活前		立即收集的培养基 +, ++, +
++		++, ++,
-		-

表1. 瓣膜内皮细胞初步分离方案的结果。

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讨论

由于技术上的困难，难以分离和培养纯的瓣膜内皮细胞，这阻碍了对瓣膜生物学的理解。传统的分离技术通常涉及对下方基底基质进行酶消化或化学解离内皮细胞的黏附连接2,3。初步的分离实验通过改变解离试剂和孵育时间进行了定性评估。实验结果表明，使用EDTA（或胰蛋白酶-EDTA）孵育长达60分钟仍未能有效解离细胞。然而，采用胶原酶消化5至10分钟即可有效获得足够数量的纯瓣膜内皮细胞（表1）。其他酶溶液也被提出，例如添加分散酶（dispase），这是一种金属蛋白酶，可特异性靶向胶原蛋白IV型和纤连蛋白，而这两种成分是下方基质的主要组成部分4。获得的细胞可通过克隆扩增或磁珠分选等进一步处理方法进行纯化5。

最近的证据表明，主动脉瓣含有多种异质性的细胞类型，这可能在评估细胞表型时带来困难。与血管内皮不同，瓣膜内皮细胞（VEC）应垂直于流体流动方向排列6。VEC 的转录谱依赖于其所在瓣膜的特定侧面以及机械微环境。体内研究已鉴定出主动脉侧与心室侧内皮具有不同的内皮细胞表型。基因表达谱表明，主动脉侧瓣...

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致谢

本研究由美国国家科学基金会（NSF）职业奖、哈特韦尔基金会以及美国心脏协会（#0830384N）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco’s Modified Eagle MediumMediatech, Inc.50-103-PB
胎牛血清GIBCO, by Life Technologies26140
青霉素-链霉素GIBCO, by Life Technologies15140-122
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGIBCO, by Life Technologies25200
肝素钠盐Sigma-AldrichH4784-1G
II型胶原酶Worthington BiochemicalLS004176
DPBSGIBCO, by Life Technologies21300-058
大鼠尾胶原BD Biosciences354236
关键拭子VWR international89031-270
碳酸氢钠Sigma-Aldrich55761
T25 培养瓶BD Biosciences353018
T75 培养瓶BD Biosciences353136
24 孔板Falcon BD353047
60x15 mm 培养皿VWR international25384-092
60x15 mm 玻璃培养皿VWR international89000-310
石蜡包埋蜡Electron Microscopy Sciences19304-01
精密滑动针头BD Biosciences305165
500 mL Nalgene 滤器VWR international73520-985
1 L Nalgene 滤器VWR international73520-986
组织镊Fine Science Tools11023-15
FSC 镊子 #5Fine Science Tools11295-00

参考文献

  1. Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
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  3. Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
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