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估算水生系统中的病毒生成速率

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DOI：

10.3791/2196

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2010年9月22日

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1Department of Microbiology, University of Tennessee

本文内容

摘要

通过减少与重现技术，可以估算海洋和淡水系统中病毒的更替速率。这些数据使研究人员能够推断水生系统中由病毒介导的微生物死亡率。

摘要

病毒是海洋和淡水系统中普遍存在的组分，已知其为微生物死亡的重要驱动因素。对这一过程进行定量估算至关重要，因为这有助于我们建立更精确的微生物群落结构与功能模型，并加深对病毒如何改变水生生物地球化学循环的理解。病毒减少技术可使研究人员估算病毒颗粒从本地微生物群落中释放的速率。简而言之，该方法通过降低样品中游离（胞外）病毒的丰度，同时将微生物群落维持在接近环境浓度的水平。随后，在无游离病毒的条件下培养微生物群落，通过群落中已被感染个体的裂解所导致的病毒重新出现的速率，可利用落射荧光显微镜，或针对特定病毒采用定量PCR进行量化。这些速率可用于估算由病毒介导的细胞裂解所导致的微生物死亡速率。

方案

1. 超滤海水以制备“无病毒”水（Wilhelm & Poorvin 2001）

  1. 尽可能无菌地采集约 20 L 的海水或湖水。
  2. 将水样通过直径为 142 mm、孔径为 0.8 μm 的聚碳酸酯滤膜进行逐级预过滤，滤膜可保存于 -20 °C 用于群落分析。对于生产力较高的水体系统，可在该步骤前使用孔径更大的滤膜。
  3. 使用 Amicon M12 系统（Millipore）时，采用截留分子量为 30 kDa 的螺旋式滤 cartridge，以去除所有病毒，包括小型 RNA 病毒。
  4. 样品处理和浓缩过程中，以约 25% 的转速运行，并维持约 15–16 kPa 的反压。
  5. 最终剩余约 500 mL 的水样将含有浓缩的病毒群落（可用于其他实验），而剩余的 19.5 L 无病毒水将用于病毒增殖测定。
  6. 每次使用 Amicon M12 系统后，必须清洗系统，以防止滤 cartridge 膜受到损坏。
  7. 若处理海水，需先用至少 6 L 的 Milli-Q 水冲洗膜，再用 0.1 N NaOH 溶液清洗 30–45 分钟。
  8. 再次用至少 6 L 的 Milli-Q 水冲洗滤 cartridge。
  9. 使用完毕后，螺旋式滤 cartridge 应保存在 4°C 的 0.05 M H3PO4 溶液中。

2. 病毒生产的病毒减量法（Wilhelm et al. 2002）

  1. 采集最多500 mL含有宿主和病毒的海水或湖水样品，置于装有孔径为0.2 μm、低蛋白吸附性的滤膜（例如Durapore）的无菌过滤装置中。
  2. 在持续使用无菌移液管重新悬浮样品以防止细菌细胞在滤膜上聚集的条件下，通过温和的真空负压（<200 mmHg）进行过滤。
  3. 缓慢向细菌悬液中加入三倍体积的超滤液，以显著减少样品中游离病毒的数量。
  4. 将细菌组分用无病毒水稀释回500 mL，均分为三个平行样本，每个150 mL，分别放入透明的250 mL聚碳酸酯瓶中。

3. 病毒生产的切向流过滤（TFF）方法（Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005）

TFF 代表了一种替代病毒削减方法的技术。

  1. 按照上述方法采集约 500 mL 的天然样品。
  2. 使用标称孔径为 0.2-μm 的切向流过滤系统浓缩该样品。
  3. 当细菌组分浓缩至约 10–15 mL 时，加入经超滤处理的无病毒水，并按上述方法分装。
  4. 将重复样品瓶置于环境培养舱中，在原位条件（in situ）下进行培养。
    1. 通过使用蓝色丙烯酸板或透明丙烯酸板配合遮光网调节光照强度，以模拟表层光照条件。
    2. 通常采用流动海水甲板培养装置来维持自然表层温度。
  5. 在 0 时刻采集用于细菌和病毒丰度测定的样品，加入无菌戊二醛至终浓度为 2.0–2.5%，并分装至冻存管中。样品立即用液氮速冻，并在冻存状态下保存直至后续处理。
    1. 若无液氮，可立即制备显微镜载玻片并进行处理（见下文操作步骤）
  6. 按照上述方法，至少在 10 小时内每 2.5 小时采集一次子样品。
    1. 此时可采集水样用于定量 PCR 分析。最多可取 5 mL 样品加入无固定剂的冻存管中，并立即用液氮速冻。

4. 病毒增殖显微技术（Noble & Fuhrman 1998，Wen et al. 2004）

  1. 用于显微镜观察的冷冻样品若需经0.02-μm滤膜过滤，应在冰上解冻。
  2. 通过将原液用无菌水按1:10稀释制备SYBR Green储备液；再从该储备液中取1 mL加入39 mL无菌水中，配制成工作液。同时，在实验开始前应预先配制50%甘油与50%磷酸盐缓冲液（PBS，0.05 M Na2HPO4，0.85% NaCl，pH 7.5）的混合溶液，以及新鲜的2.5% p-苯二胺（p-phenylenediamine）储备液。50%甘油/50% PBS混合液应保存于4°C，p-苯二胺储备液则需避光保存于-20°C，直至使用前。在过滤前立即向50%甘油/50% PBS混合液中加入p-苯二胺，使其终浓度为0.1%，作为抗荧光淬灭溶液（Antifade solution）使用。
  3. 将一张25 mm、0.02-μm的Anodisc滤膜置于0.45-μm MicronStep纤维素支撑滤膜上。将850 μL固定后的样品加至Anodisc滤膜表面，在20 pKa下抽真空至完全干燥。取100 μL SYBR Green工作液滴入无菌培养皿中，在持续抽真空条件下，小心将Anodisc滤膜从过滤装置中取出并放入SYBR Green工作液中。室温避光孵育20分钟。随后小心将滤膜从SYBR Green溶液中取出，用Kimwipe纸从滤膜背面吸去残留染料。如需要，可将滤膜重新放回过滤装置，通过加入最多800 μL经0.02-μm滤膜过滤的水或无菌培养基冲洗，以去除多余染色剂。
  4. 在显微镜载玻片上滴加少量抗荧光淬灭溶液，并将盖玻片短暂覆盖其上。取下盖玻片后，将已干燥的滤膜置于含抗荧光淬灭溶液的载玻片上，再次在盖玻片上滴加少量抗荧光淬灭溶液，缓慢将其覆盖在滤膜上，注意排除可能产生的气泡。
  5. 立即将载玻片在-20°C下冷冻保存以备后续使用（建议在数月内使用完毕，以防荧光褪色及病毒计数下降）。
  6. 采用荧光显微镜（本实验使用Leica DMRXA显微镜）结合蓝色宽波段滤光片组（激发波长λEx= 450至490 nm，发射波长λEm= 510 nm，抑制滤光片波长λ= 510 nm）对病毒进行计数。每张滤膜至少统计20个视野，并对每个视野的网格区域内的病毒总数进行定量，以确保病毒在滤膜上的分布均匀。
  7. 根据三次独立重复实验的结果，计算病毒重现率的平均值，并基于病毒产生速率确定标准差。

5. 典型结果

研究人员收集的原始数据仅需进行简单的数学处理，即可计算出病毒丰度的重现率。本研究产生的主要数据集是来自培养样品亚样本中病毒丰度的重现率。这些结果构成了每个样品中病毒丰度随时间变化的独立回归曲线。对于每个样品，单次培养视为一种处理，因此通过完成三次重复培养，研究人员可计算出变化率以及变异程度的估计值（例如，标准偏差）（见图1）。

此方法的一个局限性在于，病毒丰度的降低不可避免地会导致样品中携带病毒的宿主细胞数量减少。为弥补这一损失，必须对原始样本（未过滤的海水或湖水）以及 T = 0 小时的培养样品中的细菌丰度进行计数。这些数据可用于计算细胞损失的比例：假设降低病毒丰度的过程对微生物群落中的任何成员均无选择性，便可利用该参数来估算 原位 病毒的产生速率

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图1. 在10小时孵育期间病毒样颗粒的产生情况 原位 使用落射荧光显微镜观察条件。 样品于2008年9月在新西兰海岸外的一次浮游植物水华期间采集。

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图2. 病毒产量检测工作流程示意图 该过程首先通过超滤样品水以获得无病毒水，该步骤使用超滤系统完成。同时，从同一采样点收集平行水样，其中游离病毒通过滤膜，而微生物群落（包含感染与未感染细胞的混合物）则被截留。随后将该群落重悬于无病毒水中，并在以下条件下孵育 原位 在接下来的10小时内监测病毒的复发率，以确定病毒的产生速率。

讨论

了解病毒如何影响海洋微生物群落的一个关键环节是确定病毒颗粒的产生速率。鉴于大多数系统中病毒丰度（或多或少）处于相对稳定状态（Wilhelm & Suttle 1999，Weinbauer 2004），且病毒在水生系统中会迅速被清除或失去感染能力（Wilhelm et al. 1998），因此病毒的产生速率必须相对较快，才能弥补损失的颗粒。

估算病毒对微生物群落造成的死亡率，需要了解每次病毒裂解细胞时产生的病毒数量（即“裂解量”）。自然样品中的病毒裂解量变化很大。可通过透射电子显微镜直接测定裂解量（例如，Weinbauer & Peduzzi 1994），但这通常超出了特定实验室的能力范围，或并非总是可行。在无法通过实验测定的情况下，可采用文献中的参考值：海洋系统中每次裂解事件产生24个病毒，淡水系统中为34个病毒（Parada et al. 2006）。若将病毒产生速率除以该数值，即可得到单位体积内每日被病毒破坏的细胞丰度。再将裂解的微生物数量除以细菌的现存丰度，便可得出该系统中由病毒引起的死亡率：现有估计值范围从百分之几到接近整个种群，通常还依赖于该系统中其他因素的影响（Wilhelm & Matteson 2008）。为了确定该数值占总死亡率的百分比，通常将其乘以2（基于假设：50%的细胞继续繁殖，而50%的细胞死亡，Weinbauer 2004）。

由于营养物质和微量元素的生物可利用性（例如 N、P、Fe）可能限制水生系统中初级生产力以及随之而来的碳通量速率，因此海洋地球化学家日益关注病毒驱动的微生物死亡率在这一过程中的作用。目前已有多项估算表明，病毒每天会将大量营养元素重新释放到水体中（Rowe et al. 2008，Higgins et al. 2009），并且这些元素可被微生物群落迅速吸收利用（Poorvin et al. 2004，Mioni et al. 2005）。环境中营养物质通量的速率可通过被裂解的细胞数量乘以每个细胞所含的营养物质量（称为“配额”）来确定。这一信息可为我们理解微生物食物网在不同水生系统中的功能提供关键组成部分。

持续进展：目前，多个研究团队正在致力于调整上述策略，以对群落中特定病毒进行计数，从而确定特定生物体如何受到病毒活动的影响。为此，研究人员采用定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，同步评估特定病毒类群或病毒科的丰度，以及整个病毒群落的总体丰度。随后，这些结果被直接用于估算特定浮游生物类群的病毒致死率、营养物质周转等参数。这一强大的新方法将在未来数年内使研究人员能够更深入地探究与病毒生态学相关的过程，并首次在超越实验室系统限制的条件下，量化特定病毒-宿主群落之间的相互作用。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本文的发表得到了田纳西大学研究办公室资助项目的支持。作者感谢此前各届学生和研究人员为完善这些实验方法所付出的努力。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF-0851113、NSF-0825405 和 NSF-0550485）资助项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.5% p-苯二胺Acros Organics130575000抗荧光淬灭剂储备液
Amicon Proflux M12 系统EMD MilliporeN/A此步骤可使用任何超滤装置
SYBR Green I 核酸凝胶染料InvitrogenS-7563
Helicon S10 30 kDa 滤膜EMD MilliporeCDUF010LT
Pelicon XL 0.22 μm 滤器Fisher ScientificPXGVPPC50
GE 0.2 μm PCTE 膜滤器（47 mm）Fisher Scientific09-732-35
Millipore Labscale 切向流过滤系统EMD MilliporeXX42LSS11此步骤可使用其他切向流过滤系统
0.45 μm Micronstep 纤维素滤膜，白色无衬垫（25 mm）Fisher ScientificE04WP02500
GE Whatman 0.02 μm Anodisc 滤膜（25 mm）Fisher Scientific68-09-6002
Leica DMRXA 显微镜可使用配备蓝色滤光片组的任意落射荧光显微镜
20 L 聚碳酸酯试剂瓶Fisher Scientific
甘油Fisher ScientificBP229-4
PBS（0.05 M Na2HPO4，0.85% NaCl，pH 7.5）Fisher ScientificBP329-500, S640-500
50% 戊二醛Fisher ScientificG151-1
Corning 2 mL 冻存管—外螺纹聚丙烯Fisher Scientific09-761-71可使用任意冻存管
Corning 5 mL 冻存管—外螺纹聚丙烯Fisher Scientific09-761-74可使用任意冻存管
85% H3PO4Fisher ScientificA242-212螺旋膜储存
NaOH 颗粒Fisher ScientificS318-3M12 清洗
量筒
Isopore 0.8-μm 孔径膜滤器（142 mm）EMD MilliporeATTP14250
Millipore 不锈钢加压滤器支架（142 mm）Fisher ScientificYY30 090 00

参考文献

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PCR

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