我们描述了一种用于分离纯度高、耦联紧密的大鼠心脏线粒体的方案，适用于细胞生物能量学的功能或结构研究、生物物理测量、蛋白质组学或线粒体DNA与脂质分析。
本文内容
摘要
摘要
线粒体通过氧化磷酸化过程生成细胞ATP的功能已被广泛认知。在过去的几十年中，人们对线粒体除能量生成之外的其他功能有了显著深入的理解，这些功能包括其在细胞凋亡中的作用、作为信号转导细胞器的功能、哺乳动物的发育与衰老过程，以及在线粒体协调细胞代谢与细胞增殖中所发挥的作用。我们对线粒体调控的生物学过程的认识，依赖于从实验动物组织中分离和处理完整线粒体的可靠方法。其中，大鼠心脏来源的线粒体是过去和当前细胞代谢研究中最常见的制备材料之一，包括对基因敲除动物的研究。
本文介绍一种快速分离具有高偶联度的完整线粒体的详细方法。所制备的大鼠心脏线粒体是研究细胞生物能量学、生物分子转运、蛋白质组学以及线粒体DNA、蛋白质和脂质分析的理想材料。
方案
引言
大鼠心脏线粒体是过去和当前细胞代谢研究中最常用的制备材料之一。可以从野生型或基因敲除动物中快速、可靠地获得大量线粒体。该常规操作包括胰蛋白酶消化组织、分级分离和差速离心。
从各种组织（包括心脏，图1）中分离线粒体时，必须保持若干条件。
- 组织必须充分剪碎，因为这直接影响所获得线粒体的得率。心脏组织最好使用小型弯头剪刀进行剪碎，随后可使用Latapie组织研磨器；若无组织研磨器，也可使用出料孔直径约为1.0 mm的蒜压器代替。
- 每一步骤中溶液温度的维持至关重要。因此整个操作必须在冷室中进行，所有仪器和溶液均需提前准备并预冷。若温度条件未能保持稳定，则样品的多种特性可能丧失。线粒体结构对冷冻极为敏感，因此严禁悬浮液过度冷冻（例如在离心过程中），尤其是在需要研究主动运输功能时。
- 操作时长是一个重要参数；分离过程应尽快完成，所获得的样品必须立即使用。因此，手术器械、溶液和设备均需提前准备就绪。
材料与仪器
仪器
- 直型手术剪，尖端锋利
- 弯头剪刀
- 镊子
- 培养皿
- 小型漏斗 + 一片已预洗的尼龙滤膜
- 6 个 50 ml 烧杯
- 两个磁力搅拌器和两个冰浴装置
- 一个大型冰浴装置
- 2 个小型磁力搅拌子
- 用于刮取沉淀的刮刀
- 离心管
- Latapie 组织压榨器（可用蒜压器替代）
- 20 ml 和 1–2 ml 的特氟龙-玻璃匀浆器
- 废液烧杯
- Eppendorf 管，用于最终线粒体悬浮液及蛋白测定样品
- 冰浴装置
溶液（按每2只大鼠计算）：
- 洗涤缓冲液：0.3 M 蔗糖，10 mM HEPES（pH = 7.2），0.2 mM EDTA（1000 ml）
- 分离缓冲液：0.3 M 蔗糖，10 mM HEPES（pH = 7.4），0.2 mM EDTA，1 mg/ml BSA（Sigma A6003）（由洗涤缓冲液配制，100 ml）。牛血清白蛋白可替换为成本较低的无脂肪酸类似物。该缓冲液或其等渗变体亦可用作重悬缓冲液。
- 胰蛋白酶（Sigma T8003）溶液：2.5 mg/ml 溶于 1 mM HCl（0.5 ml）
- 大豆来源的胰蛋白酶抑制剂（Sigma T9128）：6.5 mg/10 ml 分离缓冲液
实验方案
该实验流程的总体方案如图1所示。心脏应在洗涤缓冲液中冷却并清洗，切除心室组织，切碎后在胰蛋白酶光解处理过程中进行匀浆。将悬液以低速离心，所得上清液再以较高速度离心，以收集线粒体。根据计划进行的实验，重悬缓冲液可替换为其他任何等渗溶液。
动物处死依照英国《动物（科学实验程序）法案》进行，采用颈椎脱位法，随后进行断头。动物断头后必须立即取出心脏，以确保动物处死与心脏取出之间无延迟。若需平行分离肝脏线粒体，大鼠应在实验前禁食过夜。
- 准备三个烧杯，每杯盛有40 ml洗涤缓冲液。将烧杯置于冰盐浴中冷却3至5分钟，待冰晶云状物开始出现时立即使用，注意避免过度冷冻。
- 打开断头大鼠的胸腔并取出心脏。进行小切口后，立即将心脏转移至第一个烧杯中的冰冻溶液中。挤压心脏以去除血液，然后将其放入第二个烧杯中。每颗心脏均重复此操作。
- 用滤纸将心脏吸干，去除所有脂肪、凝血、心耳和筋膜，收集心室组织。
- 在冰上的培养皿中，使用小型弯头剪刀将混合组织切碎约5分钟，直至组织颗粒大小约为1-2 mm。
- 将切碎的组织放入组织研磨器中并压过。注意会有大量组织残留在研磨器中，因此需收集研磨器壁和底部的所有心肌组织。
- 将材料转移至含有50 ml洗涤缓冲液的烧杯中并搅拌。随后将悬浮液通过尼龙滤膜过滤。用洗涤缓冲液在滤膜上清洗切碎的组织3次，并弃去滤液。
- 将洗涤后的组织转移至20 ml洗涤缓冲液中，置于磁力搅拌器的冰浴中。在持续搅拌下加入0.5 ml胰蛋白酶溶液，并启动计时器。另准备一个磁力搅拌器、冰浴及第二个50 ml烧杯。
- 第4天th 用小型松口玻璃-聚四氟乙烯匀浆器（10–15 ml）对悬浮液逐部分进行短暂匀浆，上下移动数次以充分分散悬浮液。匀浆后，将悬浮液转移至第二个烧杯中。重复上述步骤处理剩余的9th 1 分钟，使悬浮液总共均质化两次。孵育 15 分钟后，加入 10 ml 含胰蛋白酶抑制剂的分离缓冲液，再孵育 1 分钟。
- 再次通过尼龙滤器过滤悬浮液，并保留滤液。收集滤器上残留的颗粒部分，在15–20 ml洗涤缓冲液中匀浆1分钟。
- 将匀浆液与滤液混合，于600g离心15分钟。
- 将所得上清液小心过滤至新的离心管中。避免沉淀物污染，于8500g再次离心15分钟。
- 高速离心后，弃去上清液，并用1 ml缓冲液将沉淀物冲洗2–3次，每次均弃去表面蓬松的白色外层。用刮勺将沉淀物打散，但避免触及底部的红细胞红色斑点。若血液细胞已松散，应在均质化前从悬浮液中去除红色碎片。
- 用小型匀浆器重悬沉淀，或 alternatively 通过轻柔吹打重悬。用更多分离缓冲液稀释悬浮液，于 8500g 离心 15 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于重悬缓冲液（选择一种等渗缓冲液）中，再次离心。
- 所得棕色沉淀物含有经洗涤的完整线粒体。用少量您所选择的等渗缓冲液重悬沉淀物。
图1. 分离大鼠心脏线粒体的逐步操作示意图。上半部分，步骤1-9：组织破碎、胰蛋白酶处理和匀浆；下半部分，步骤10-15：差速离心。
讨论
本文描述了一种快速分离具有高度偶联功能的完整线粒体的详细方案。所获得的线粒体制剂可用于细胞生物能量学的功能或结构研究、蛋白质组学研究，或线粒体DNA及脂质含量分析。也可用于离子和代谢中间产物主动运输的生物物理研究。该线粒体制剂还可进一步处理，以分离亚线粒体颗粒、外膜，或纯化氧化磷酸化系统的各个组分。本方法是在Jacobus和Saks1建立的标准分离方案基础上的改进。每颗心脏组织预期可获得约10–15 mg线粒体蛋白，以苹果酸/谷氨酸为底物时，其呼吸控制比在8至12之间，23°C条件下，State IV呼吸速率约为0.12 μmol O2xmin-1xmg蛋白-1，反应介质组成为0.25 M蔗糖、10 mM KCl、0.2 mM EDTA、5 mM磷酸钾（pH 8.0），并加入150 μM ADP以启动State III呼吸（具体实验条件和添加物详见参考文献2）。
在开始分离操作之前，应特别注意几个技术细节。必须使用洁净的聚碳酸酯或聚丙烯离心管，因此应使用干净的刷子和热水彻底清洗离心管，但应尽量减少洗涤剂的使用。此外，最好在分离前一日将所有必需的玻璃器皿和仪器放置于冷室中。
在分离过程中将缓冲液从烧瓶转移至烧杯时，需特别注意防止冰水滴入溶液中。处理组织时应强调，心脏的取出应尽快进行，因为动物断头后若未能立即冷却组织，即使短暂的延迟也会导致线粒体部分解偶联。迅速冷却并充分洗涤取出的心脏，对于获得不含血红蛋白和红细胞NAD酶的标准制备物至关重要。
胰蛋白酶用于降解结缔组织蛋白，以增加组织在匀浆过程中对剪切力的敏感性。应避免组织长时间暴露于蛋白酶中，因为这会导致线粒体质量下降。
高速离心后，应使用擦镜纸擦拭离心管管壁，以去除管壁上积聚的脂肪类物质沉淀。
在最终重悬时，最好使用少量的终末缓冲液，以尽量减少储存期间线粒体功能的损失（每心脏使用150至200 μl缓冲液）。在进行二价阳离子转运研究时，终末制备液中不得含有任何螯合剂，因此线粒体应使用不含EGTA的介质反复洗涤，并在分离后的最初几小时内使用。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 A. Vinogradov 教授和 Vera Grivennikova 博士将作者们引入线粒体生物学领域，并在此实验方案中提供了许多有益的见解和建议。作者们感谢女王大学媒体办公室的 Amanda McKintock 女士在视频制备过程中提供的帮助。
参考文献
- Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
- Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).
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