本文旨在逐步描述常用的方法 体外 用于研究施万细胞-星形胶质细胞相互作用的检测方法
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
施万细胞是脊髓损伤后修复策略中常用的细胞之一。施万细胞能够通过分泌生长因子1,2，提供促进生长的黏附分子3以及细胞外基质分子4，支持轴突的再生与出芽。此外，它们还能在损伤部位对脱髓鞘的轴突进行再髓鞘化5。
然而，移植后施万细胞不会从植入部位迁移，也不会与宿主星形胶质细胞混合6,7。这导致施万细胞与星形胶质细胞之间形成明显的边界，从而阻碍轴突从移植物近端和远端重新生长进入宿主组织。与施万细胞接触的星形胶质细胞还会发生肥大，并上调抑制性分子的表达8-13。
体外 实验已被用于模拟施万细胞与星形胶质细胞之间的相互作用，并在理解细胞行为潜在机制方面发挥了重要作用。
这些 体外 实验方法包括边界分析法，即通过两种不同细胞共培养，每种细胞占据不同的区域，两群细胞前沿之间仅留有微小间隙。随着细胞分裂和迁移，两个细胞前沿逐渐靠近并最终发生碰撞，从而可在边界处分析两种细胞群体的行为。该技术的另一种变体是将两种细胞群体在培养中混合，随着时间推移，两类细胞发生分离，其中施万细胞聚集成岛状结构，分布于星形胶质细胞之间，从而形成多个施万细胞-星形胶质细胞边界。
研究两种细胞类型相互作用所采用的第二种方法是迁移实验，该实验可追踪细胞在另一种细胞单层表面的移动情况14,15。该实验通常被称为倒置盖玻片实验。将施万细胞培养在小块玻璃碎片上，然后将其倒置并贴附于星形胶质细胞单层表面，随后从盖玻片边缘评估细胞的迁移情况。
这两种检测方法在研究细胞排斥和边界形成的潜在机制方面发挥了重要作用。利用这些技术鉴定出的一些分子包括N-钙黏蛋白15、硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）16,17、FGF/肝素18、Eph/ephrin19。
本文旨在逐步描述边界测定法和迁移测定法，并阐明可能遇到的技术问题。
方案
1. 边界实验：
- 基础准备：实验开始前，将腔室载玻片在聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）溶液中包被过夜，并准备好无菌玻璃盖玻片。使用杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM），添加10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素B（PSF）配制培养基。同时准备一瓶无钙镁的汉克斯平衡盐溶液（Calcium/Magnesium free Hanks balanced salt solution, HBSS）。
- 原代大鼠施万细胞在培养瓶中用0.1%胰蛋白酶消化3分钟；原代大鼠星形胶质细胞则用0.1%胰蛋白酶消化5分钟。
通过加入含10% FCS和1% PSF的DMEM终止胰蛋白酶活性。 - 消化后的施万细胞和星形胶质细胞分别转移至两个15 mL离心管中，在300G条件下离心5分钟。
- 将施万细胞和星形胶质细胞重悬，调整细胞密度至2 × 106（细胞密度的变化参见代表性结果部分）。
- 取50 μL施万细胞悬液滴加于PDL包被的腔室载玻片一端的孔中，用玻璃条将液滴向孔中央涂抹，形成一条直线边缘。（使用玻璃切割器将矩形玻璃盖玻片纵向切割，使其宽度适合用于边界实验的腔室载玻片）
- 在同一孔的另一端滴加第二滴50 μL星形胶质细胞悬液，并向中心方向涂抹，形成与第一滴平行的直线边缘，两者之间保留约0.2 mm的小间隙。
- 将....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
上述检测方法已用于多项研究，以阐明多种因素在施万细胞-星形胶质细胞边界形成以及施万细胞在星形胶质细胞环境中迁移受限过程中的作用。
理解这些事件背后的机制至关重要，因为这将有助于开发出优化和增强施万细胞移植物在移植后整合的策略，从而促进再生的轴突从移植物重新进入宿主组织，并与宿主组织建立连接。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢Philippa Warren的热心帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| 盖玻片 | VWR international | 631-0149 | |
| 盖玻片（矩形） | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| 培养皿载片 | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4孔板，6孔板 | Nalge Nunc international | 4孔板6孔板 | |
| 大鼠p75抗体 | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP抗体 | Dako | Z0334 | |
| 二抗（Alexa标记） | Invitrogen | A-11004 A-11034 | 羊抗小鼠568 羊抗兔488 |
| 生物素化二抗 | Vector Laboratories | 羊抗小鼠 | |
| DAB片剂 | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC Elite试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
参考文献
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimul....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
