本文旨在逐步描述常用的方法 体外 用于研究施万细胞-星形胶质细胞相互作用的检测方法
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摘要
摘要
施万细胞是脊髓损伤后修复策略中常用的细胞之一。施万细胞能够通过分泌生长因子1,2，提供促进生长的黏附分子3以及细胞外基质分子4，支持轴突的再生与出芽。此外，它们还能在损伤部位对脱髓鞘的轴突进行再髓鞘化5。
然而，移植后施万细胞不会从植入部位迁移，也不会与宿主星形胶质细胞混合6,7。这导致施万细胞与星形胶质细胞之间形成明显的边界，从而阻碍轴突从移植物近端和远端重新生长进入宿主组织。与施万细胞接触的星形胶质细胞还会发生肥大，并上调抑制性分子的表达8-13。
体外 实验已被用于模拟施万细胞与星形胶质细胞之间的相互作用，并在理解细胞行为潜在机制方面发挥了重要作用。
这些 体外 实验方法包括边界分析法，即通过两种不同细胞共培养，每种细胞占据不同的区域，两群细胞前沿之间仅留有微小间隙。随着细胞分裂和迁移，两个细胞前沿逐渐靠近并最终发生碰撞，从而可在边界处分析两种细胞群体的行为。该技术的另一种变体是将两种细胞群体在培养中混合，随着时间推移，两类细胞发生分离，其中施万细胞聚集成岛状结构，分布于星形胶质细胞之间，从而形成多个施万细胞-星形胶质细胞边界。
研究两种细胞类型相互作用所采用的第二种方法是迁移实验，该实验可追踪细胞在另一种细胞单层表面的移动情况14,15。该实验通常被称为倒置盖玻片实验。将施万细胞培养在小块玻璃碎片上，然后将其倒置并贴附于星形胶质细胞单层表面，随后从盖玻片边缘评估细胞的迁移情况。
这两种检测方法在研究细胞排斥和边界形成的潜在机制方面发挥了重要作用。利用这些技术鉴定出的一些分子包括N-钙黏蛋白15、硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）16,17、FGF/肝素18、Eph/ephrin19。
本文旨在逐步描述边界测定法和迁移测定法，并阐明可能遇到的技术问题。
方案
1. 边界实验：
- 基础准备：实验开始前，将腔室载玻片在聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）溶液中包被过夜，并准备好无菌玻璃盖玻片。使用杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM），添加10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素B（PSF）配制培养基。同时准备一瓶无钙镁的汉克斯平衡盐溶液（Calcium/Magnesium free Hanks balanced salt solution, HBSS）。
- 原代大鼠施万细胞在培养瓶中用0.1%胰蛋白酶消化3分钟；原代大鼠星形胶质细胞则用0.1%胰蛋白酶消化5分钟。
通过加入含10% FCS和1% PSF的DMEM终止胰蛋白酶活性。 - 消化后的施万细胞和星形胶质细胞分别转移至两个15 mL离心管中，在300G条件下离心5分钟。
- 将施万细胞和星形胶质细胞重悬，调整细胞密度至2 × 106（细胞密度的变化参见代表性结果部分）。
- 取50 μL施万细胞悬液滴加于PDL包被的腔室载玻片一端的孔中，用玻璃条将液滴向孔中央涂抹，形成一条直线边缘。（使用玻璃切割器将矩形玻璃盖玻片纵向切割，使其宽度适合用于边界实验的腔室载玻片）
- 在同一孔的另一端滴加第二滴50 μL星形胶质细胞悬液，并向中心方向涂抹，形成与第一滴平行的直线边缘，两者之间保留约0.2 mm的小间隙。
- 将含有细胞液滴的腔室载玻片置于37°C培养箱中孵育2小时。
- 2小时后，用DMEM洗涤培养物以去除未贴壁的细胞碎片，并加入新鲜培养基（DMEM/10% FCS/1% PSF）。
注意：DMEM/10% FCS/1% PSF培养基可额外补充佛司可林（forskolin，2μM）和牛垂体提取物（BPE，10μg/mL），以促进施万细胞增殖。BPE可提供支持施万细胞长期培养所需的生长因子，而佛司可林则通过提高施万细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平诱导其增殖。 - 细胞在37°C、7% CO2培养箱中培养约8–10天，每3天更换一次培养基。两种细胞的前沿最终会相遇，在两类细胞之间形成清晰的边界。此时可开展相关实验，分析参与边界形成的因子。
- 共培养体系可用4%甲醛固定，施万细胞使用抗P75抗体进行免疫染色，星形胶质细胞使用抗GFAP抗体染色，以区分共培养中的不同细胞类型。P75抗体识别施万细胞表面的低亲和力NGF受体，该受体在星形胶质细胞中缺失；抗GFAP抗体识别定位于星形胶质细胞胞质中的胶质纤维酸性蛋白。（代表性边界图像请见图1A）
2. 迁移实验：
- 将4孔板（每孔直径15 mm）用PDL包被过夜，用于制备星形胶质细胞单层。
- 使用0.1%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞培养物进行胰酶消化5分钟。加入含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素（PSF）的DMEM培养基以终止胰酶反应，并在300×g离心5分钟。（见图2）
- 将星形胶质细胞重悬于1×105 个细胞/mL的培养基中，每孔PDL包被的4孔板中加入1 mL该细胞悬液。星形胶质细胞培养24–48小时，直至形成完全融合的单层。
- 为评估施万细胞在星形胶质细胞单层上的迁移能力，在制备星形胶质细胞单层的同时，将圆形PDL包被的玻璃盖玻片放入50 mL离心管中，用塑料移液器碾碎，以获得小片状玻璃碎片。
- 将玻璃碎片转移至6孔板中的一个孔内，用镊子挑选合适大小的碎片并移至其他孔中。每个6孔板的孔中放置5片玻璃碎片。
- 对培养于培养瓶中的原代施万细胞使用0.1%胰蛋白酶消化3分钟。将消化后的施万细胞转移至15 mL离心管中，在300×g离心5分钟。将施万细胞重悬于DMEM/10%FCS/1%PSF培养基中，浓度为2×106 个细胞/mL。
- 在6孔板中每个含有5片玻璃碎片的孔上，各加入20 μL施万细胞悬液，并在37°C、7% CO2条件下孵育2小时。
- 2小时后，施万细胞已贴附于玻璃碎片表面，向每孔中加入含2 μM佛司可林（forskolin）和10 μg/mL牛垂体提取物（BPE）的DMEM/10%FCS/1%PSF培养基，确保碎片完全浸没于培养基中。
- 将含有玻璃碎片的6孔板置于培养箱中继续培养24–48小时，直至玻璃碎片表面被施万细胞完全覆盖。
- 当玻璃碎片表面形成完全融合的施万细胞层后，使用尖头镊子小心夹起每一片碎片，浸入HBSS中以去除未贴附的细胞，然后将碎片细胞面朝下倒置放置于星形胶质细胞单层上。
- 每孔加入1 mL DMEM/10%FCS/1%PSF培养基覆盖碎片，允许施万细胞迁移24至48小时。在此期间，可加入实验试剂（如生长因子），以评估其对施万细胞迁移数量和迁移距离的影响。
- 迁移期结束后，向每孔加入4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟，使玻璃碎片牢固附着于孔底。固定完成后，对施万细胞进行免疫染色，使用抗p75抗体（识别低亲和力神经生长因子受体），随后采用ABC链霉亲和素-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒显色，以便在光学显微镜下观察施万细胞。
3. 代表性结果：
培养8-10天后，雪旺细胞与星形胶质细胞的共培养体系中会形成两种细胞类型之间的清晰边界。若在培养中使用佛司可林（forskolin）和牛垂体提取物（BPE），该边界更为明显，因为这些成分可促进雪旺细胞的增殖。
如果在10天内未观察到边界形成，可进一步延长培养时间，直至边界建立。改变细胞密度比例是促进边界形成的另一种方法。在制备细胞悬液时，可采用3:1的施万细胞与星形胶质细胞密度比例8,18。
在通过免疫染色鉴定施万细胞和星形胶质细胞后，可通过在确定的边界处画一条线，以评估细胞的相互混合情况，并在荧光显微镜下计数迁移至星形胶质细胞区域内的施万细胞数量。
以下是获得边界区域的两个图像示例，其中一个显示施万细胞与星形胶质细胞形成了清晰的分隔区域（图1A），而另一个由于操作技术不佳，细胞未能很好地分隔到不同区域（图1B）。
图1. 边界实验：施万细胞与星形胶质细胞相互作用。A) 在佛司可林和BPE存在下共培养10天，以促进施万细胞增殖，结果显示两种细胞类型之间形成清晰的边界（红色=P75，绿色=GFAP）。B) 一个10天的共培养实验，其中未形成明显边界，两种细胞前沿相互混合。这是由于在制备边界时，将星形胶质细胞和施万细胞的液滴并排放置过程中发生了液滴混合所致（红色=P75，绿色=GFAP）。
图 2. 星形胶质细胞融合单层的代表性图像
迁移实验用于评估一种细胞在另一种细胞表面的移动，因此所研究的现象与边界形成不同。
操作时需要练习，以确保将盖玻片翻转至单层细胞上时，尖头镊子不会损伤覆盖有施万细胞的玻璃碎片及星形胶质细胞单层。为评估施万细胞的迁移情况，可在光学显微镜下测量从盖玻片边缘迁移的细胞最大迁移距离以及迁移细胞的数量。
以下是使用DAB染色法在星形胶质细胞单层表面进行P75抗体染色的施万细胞图像（图3）。
图3. 使用倒置盖玻片法进行迁移实验。
A) 施万细胞（棕色，用p75抗体免疫染色）从盖玻片边缘向外迁移。箭头指示细胞从盖玻片边缘迁移的方向。
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讨论
上述检测方法已用于多项研究，以阐明多种因素在施万细胞-星形胶质细胞边界形成以及施万细胞在星形胶质细胞环境中迁移受限过程中的作用。
理解这些事件背后的机制至关重要，因为这将有助于开发出优化和增强施万细胞移植物在移植后整合的策略，从而促进再生的轴突从移植物重新进入宿主组织，并与宿主组织建立连接。
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致谢
我们感谢Philippa Warren的热心帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| 盖玻片 | VWR international | 631-0149 | |
| 盖玻片（矩形） | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| 培养皿载片 | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4孔板，6孔板 | Nalge Nunc international | 4孔板6孔板 | |
| 大鼠p75抗体 | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP抗体 | Dako | Z0334 | |
| 二抗（Alexa标记） | Invitrogen | A-11004 A-11034 | 羊抗小鼠568 羊抗兔488 |
| 生物素化二抗 | Vector Laboratories | 羊抗小鼠 | |
| DAB片剂 | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC Elite试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
参考文献
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