紫外线诱导的复制中间体的可视化 E. coli 使用二维琼脂糖凝胶分析

摘要

我们介绍了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定紫外线照射后产生的复制中间体结构的实验方法。

摘要

在DNA损伤存在的情况下，不准确的复制是所有细胞类型中观察到的大多数细胞重排和诱变现象的主要原因，并且普遍认为其与人类癌症的发生直接相关。DNA损伤（例如由紫外线照射引起的损伤）会严重损害复制过程准确拷贝基因组模板的能力。已有若干基因产物被鉴定出来，它们在复制遇到模板中的DNA损伤时是必需的。然而，目前仍面临的一个挑战是如何确定这些蛋白质在复制过程中处理损伤的机制。in vivo. 以大肠杆菌为模型系统，我们描述了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定复制质粒上产生的结构中间体的实验方法in vivo在紫外线诱导的DNA损伤之后。该方法已被用于证明，由紫外线诱导的损伤所阻滞的复制叉会发生短暂的逆转，这种逆转由RecA及若干与RecF途径相关的基因产物共同稳定。该技术表明，这些复制中间体会持续存在，直至与核苷酸切除修复清除损伤位点的时间相吻合，随后DNA复制恢复。

方案

1. 生长与紫外照射。

1. 取200μl在DGCthy培养基（Davis培养基¹中添加0.4%葡萄糖、0.2%酪蛋白氨基酸和10 μg/ml胸腺嘧啶）中过夜培养并含有pBR322质粒的新鲜培养物，加入100 μg/ml氨苄青霉素，离心收集菌体。将菌体沉淀重悬于200μl不含氨苄青霉素的DGCthy培养基中，并用于接种20 ml DGCthy培养基。
2. 在37°C摇床培养箱中，将培养物在无氨苄青霉素选择压力下培养至OD₆₀₀为0.5（约5 × 10⁸ 个细胞/ml）。在无氨苄青霉素条件下培养可避免对某些突变体中可能出现的异常或无功能复制中间体产生选择性压力。此外，若使用紫外光诱导损伤，则必须从培养基中去除氨苄青霉素，因其在该波长范围内有强吸收，会屏蔽细胞，降低有效紫外剂量。
3. 在黄光灯下操作，将培养物置于直径15 cm的培养皿中，并放置于旋转平台上以保持搅动。将培养皿置于距离15瓦杀菌灯一定距离处，使照射强度约为1 J/m²/sec（使用UVC光度计测定），进行照射。培养物接受50 J/m²剂量照射后，立即放回37°C摇床培养箱中继续培养直至实验结束。该剂量平均在每4.5 kb单链DNA中产生1个环丁烷嘧啶二聚体。黄光照明可防止光复活——即光解酶介导的环丁烷嘧啶二聚体的修复。

2. DNA 提取

1. 当需要检测复制中间体时，取 0.75 ml 培养物加入到 0.75 ml 冰冷的 NET30 缓冲液（100 mM NaCl、10 mM Tris，pH 8.0、30 mM EDTA）中，并置于冰上直至时间进程实验结束。我们通常进行 90 分钟的时间进程实验，分别在 0、15、30、45、60 和 90 分钟取样。EDTA 和低温可有效终止复制及核苷酸切除修复过程。
2. 将每个样品离心沉淀后，重悬于 150 μl 含 1.5 mg/ml 溶菌酶和 0.2 mg/ml RNaseA 的 TE 缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA）中，在 37°C 裂解 20 分钟。随后加入 10 μl 蛋白酶 K（10 mg/ml）和 10 μl 20% Sarkosyl，继续孵育 1 小时。蛋白酶 K 和 Sarkosyl 可在苯酚抽提前帮助释放可能与膜或蛋白质结合的 DNA 片段。由于活跃复制的 DNA 常与蛋白质或膜复合物结合，此步骤有助于提高回收复制片段的得率。
3. 向每个样品中加入 2 倍体积的苯酚，轻轻颠倒离心管混匀 5 分钟。然后加入 2 倍体积的氯仿/异戊醇（24:1），再次轻轻颠倒混匀 5 分钟。
4. 将样品在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 5 分钟，收集上层水相转移至新管中。随后加入 4 倍体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀 5 分钟，再次以 14,000 rpm 离心 5 分钟。
5. 将各样品的上层水相进行透析：取 100 μl 样品点样于漂浮在盛有 250 ml 0.1X TE 的烧杯中的 47 mm Whatman 0.025 μm 孔径滤膜上，透析 1 小时。由于含有单链区域或分支点的复制结构更易受到剪切力破坏，我们通常用剃刀片切去移液器吸头末端以增大开口，从而最小化剪切力。一般情况下，在 DNA 经限制性内切酶消化前应尽量减少移液操作。
6. 每个样品随后用 PvuII（New England Biolabs）进行消化，该酶可在复制起点下游将质粒线性化。
7. 上样前，向每个样品中加入 100 μl 氯仿和 20 μl 含溴酚蓝和二甲苯蓝的 6X 上样染料，混匀。然后取 40 μl 含上样染料的水相上样至琼脂糖凝胶。为避免结构偏差、人工假象及 DNA 剪切，本分离流程在细胞裂解后不包含任何富集单链区域、沉淀或浓缩 DNA 样品的步骤。

3. 二维凝胶电泳与Southern分析。

1. 二维琼脂糖凝胶分析方法经文献3改良而来。第一维电泳中，将酶切后的DNA样品在1× TBE缓冲液中，以1 V/cm的电压通过0.4%琼脂糖凝胶进行电泳。1升10× TBE贮存液的配制如下：
   • 108 g Tris碱
   • 55 g 硼酸
   • 40 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）
2. 在第一泳道加入λ Hind III DNA分子量标准，随后每隔一泳道加样。第一维电泳通常运行约12–15小时。跳过泳道加样有助于在第二维电泳时更方便地切出所需泳道。低电压和低浓度琼脂糖凝胶主要根据DNA片段的大小进行分离。
3. 进行第二维电泳时，使用大型切肉刀从第一维凝胶中切出泳道。含有λ Hind III标记的第一泳道可用溴化乙锭染色。以λ Hind III标记为参照，裁剪并弃去预计线性化质粒迁移位置以下的凝胶区域。在本实验条件下，我们发现线性化的pBR322迁移位置略高于二甲苯青染料条带。
4. 进行第二维凝胶制备时，将每条泳道水平放置于空的凝胶制胶槽顶部。配制1.0%琼脂糖的1× TBE溶液，并冷却至55°C。此时将该凝胶溶液倒入制胶槽中，确保完全覆盖凝胶条带。待凝胶凝固后，在允许缓冲液循环的电泳装置中以6.5 V/cm的电压进行电泳。第二维电泳通常运行约5.5–7小时。高电压和高浓度琼脂糖凝胶可有效根据DNA片段的构象以及大小进行分离。非线性构象的DNA在第二维中迁移较慢。
5. 电泳结束后，将凝胶用H₂O冲洗，随后在400 ml 0.25 M盐酸中洗涤两次，每次15分钟；再用H₂O冲洗，然后在400 ml 0.4 M NaOH中洗涤两次，每次30分钟。酸处理可使DNA分子部分切口化，产生更小的片段，从而提高转膜效率。由于DNA复制中间体分子量大且构象特殊，此步骤必不可少。
6. 将凝胶中的DNA转移至Hybond N+尼龙膜⁴上。我们采用向下碱转移系统，使用0.4 M NaOH。具体操作：将两张浸透0.4 M NaOH的滤纸置于大量纸巾堆上，尼龙膜也浸入0.4 M NaOH后放置于滤纸上，再小心将凝胶覆盖其上，随后覆盖另一张用NaOH溶液润湿的滤纸。最后，将一张长条状润湿滤纸横跨于顶部，其两端分别浸入盛有1 L 0.4 M NaOH溶液的容器中作为引流芯。DNA转移通常持续6–12小时。
7. 取出尼龙膜，用5× SSC缓冲液洗涤20–30秒，然后放入含有10.5 ml预杂交液的杂交滚瓶中。将膜在42°C下旋转孵育超过6小时。预杂交液配方如下：
   • 5.0 ml 甲酰胺
   • 0.5 ml 20% SDS
   • 2.5 ml 20× SSC*
   • 2.0 ml 50× Denhardt's*
   • 0.5 ml 鲑精DNA（10 mg/ml）
     *SSC和Denhardt's溶液的配制方法见文献5
8. 在预杂交期间，按照Roche公司提供的说明书，使用α标记的[32-P]-dCTP通过缺口平移法对1 μg pBR322质粒进行32P标记。将放射性标记的探针（100 μl）置于螺旋盖微量离心管中，在98°C孵育10分钟使其变性，随后立即置于冰上。
9. 将变性后的探针加入5.9 ml杂交液中，杂交液组成如下：
   • 3.0 ml 甲酰胺
   • 1.5 ml SSC
   • 1.0 ml H₂O
   • 0.15 ml 50× Denhardt's
   • 0.10 ml 20% SDS
   • 0.15 ml 10 mg/ml 鲑精DNA
10. 倒出滚瓶中的预杂交液，加入杂交液。将滚瓶放回42°C孵育箱中，旋转孵育超过12小时。
11. 倒出杂交液，随后在滚瓶中用约150 ml含0.5× SSC和0.1% SDS的洗涤液，在42°C下旋转洗涤4次，每次20分钟。
12. 最后一次洗涤后，将膜置于纸巾上，直至液体明显消失。然后用聚氯乙烯塑料膜包裹膜，并暴露于磷屏成像仪的成像屏上。我们使用Storm 840成像系统及其配套的ImageQuant软件对放射性信号进行可视化和定量分析。

4. 典型结果：

图1. 在存在和不存在UV诱导DNA损伤的情况下观察到的质粒复制中间体。 图示为通过二维琼脂糖凝胶分析观察到的PvuII酶切pBR322质粒的迁移模式。非复制型线性质粒以4.4 kb的线性片段形式迁移。复制中的质粒形成Y形结构，因其尺寸更大且形状非线性，迁移速度较非复制片段更慢。该迁移模式形成一条从线性区域向外延伸至加样孔方向的弧线。经紫外线照射后，在迁移速度比Y形分子弧线更慢的锥形区域中可观察到双Y形或X形分子。图中展示了用³²P标记的pBR322探针进行Southern杂交分析二维凝胶的一个示例，分别显示细胞在紫外线照射后立即取样以及照射后15分钟的分析结果（经出版方许可转载）。

讨论

图1展示了在有无紫外线诱导损伤的情况下，从野生型细胞中获得的典型结果。在无损伤情况下，当细胞处于快速指数生长期时，总质粒DNA中约有1%存在于Y弧中。经照射后，随着复制叉在损伤位点处受阻并积累，Y形分子出现短暂增加。X形复制中间体也短暂积累，并持续存在，直至与损伤修复的时间点相对应。

可以使用塑料吸管将复制中间体从凝胶中 punched out（打孔取出），替代 Southern 杂交分析，经纯化后直接通过电子显微镜观察。我们已成功利用该方法鉴定出在复制叉遭遇 DNA 损伤时所需的关键基因产物，并鉴定了在这些突变体中积累的异常复制中间体。此外，该方法还可轻松改进以检测其他形式的 DNA 损伤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2D 凝胶 Southern 杂交分析示例	GE Healthcare	G15T8	黄色照明灯
15 μwatt 杀菌灯	Sylvania	F20T12/GO	紫外灯
Blak-Ray 254 nm 紫外强度计	Daigger	EF28195T	UVC 光度计
0.025 μm 孔径透析盘	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	漂浮式透析盘
PvuII	Fermentas	ER0632	限制性内切酶
缺口平移试剂盒	Roche Group	976776	用于制备 32P 标记探针
吸水纸	Whatman, GE Healthcare	3030-704	用于 Southern 转印
尼龙膜	GE Healthcare	RPN203S	用于 Southern 转印