由紫外线引起的复制中间体的可视化 E。大肠杆菌使用二维的琼脂糖凝胶电泳分析

Summary

我们目前可以使用其中的一个两维的琼脂糖凝胶电泳分析，以确定紫外线照射后发生的复制中间体的结构的过程。

Abstract

在DNA损伤的存在不准确的复制是负责大部分的细胞重排，并观察在所有类型的细胞，是人们普遍认为，直接与人类的癌症发展相关的突变。如紫外线照射引起的的DNA损伤，严重损害了精确重复的基因组模板的复制能力。已经确定的基因产物，需要复制时，在模板中遇到的DNA损伤。然而，剩下的挑战已确定在复制过程中如何将这些蛋白质的过程中病变

Protocol

1。增长和紫外线照射。

1. 200μL新鲜隔夜生长在戴维斯中型¹辅以葡萄糖0.4％，0.2％casamino酸，和10微克/毫升胸腺嘧啶（DGCthy中型）和100μg/ mL氨苄青霉素质粒pBR322的文化沉淀。然后，细胞沉淀悬浮于200μLDGCthy缺乏氨苄青霉素介质和使用的预防针DGCthy中等20毫升。
2. 文化是生长没有氨苄青霉素选择一个摇床中于37 ° C为0.5外径_600（〜5 × 10 ⁸细胞/毫升）。没有氨苄青霉素增长避免了对异常或非生产性的复制中间体中可能出现的一些突变体的选择。此外，如果用紫外线光诱导损伤，从媒体清除氨苄青霉素是必要的，因为它吸收了强烈的细胞在这些波长和盾牌，减少紫外线的有效剂量。
3. 黄色的灯光下工作，文化是一个躁动的旋转平台上放置在直径15厘米的培养皿。我们的文化是放置在一个15瓦杀菌灯产生的〜1 J/m2/sec，这是使用紫外线光度计测量的照射量率的距离。文化是照射50 J/m2然后立即放回晃动在实验期间的37℃培养箱中培养。此剂量产生的，平均1环丁烷嘧啶二聚体每4.5 kb的单链DNA。黄色灯光防止光解环丁烷嘧啶二聚体的光复活逆转。

2。 DNA的提取。

1. 在复制中间体进行审查的时候，文化0.75毫升等分放入0.75毫升冰冷NET30缓冲区（pH值8.0，100毫米氯化钠，10毫米三，....

Discussion

图1显示了典型的从野生型细胞的存在和紫外线损伤的情况下取得的结果。 〜1％的总质粒DNA损害的情况下，可以发现，在Y弧，当细胞迅速增长指数相。照射后，在Y形分子的瞬时增加观察堵塞的复制叉积累损坏的网站。 X形复制的中​​间体，也瞬时积累和坚持，直到一段时间，当病变修复相关。

南分析，可以砸出复制中间体的凝胶，用塑料吸管，纯化，并直接通过电子显微镜观察。我们已经用这种方法成功地识别过程中遇到的DNA损伤，并确定在这些突变体积累的异常复制中间体的复制叉需要的基因产物。此外，这种方法可以很容易地修改，以探讨其他形式的DNA损伤。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D 凝胶的 Southern 分析实例	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μ瓦特杀菌灯	Sylvania	F20T12/GO	紫外线灯
Blak-Ray 紫外线强度计 254nm	Daigger	EF28195T	UVC 光度计
0.025 μm 孔盘	Whatman，GE Healthcare	VSWP04700	浮动透析盘
PvuII	Fermentas	ER0632	限制性核酸内切酶
缺口翻译试剂盒	罗氏集团	976776	制作 32P 标记探针
印迹纸	Whatman，GE Healthcare	3030-704	用于南方转移
尼龙膜	GE Healthcare	RPN203S	南方接送