紫外线诱导的复制中间体的可视化 E. coli 使用二维琼脂糖凝胶分析

摘要

我们介绍了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定紫外线照射后产生的复制中间体结构的实验方法。

摘要

在DNA损伤存在的情况下，不准确的复制是所有细胞类型中观察到的大多数细胞重排和诱变现象的主要原因，并且普遍认为其与人类癌症的发生直接相关。DNA损伤（例如由紫外线照射引起的损伤）会严重损害复制过程准确拷贝基因组模板的能力。已有若干基因产物被鉴定出来，它们在复制遇到模板中的DNA损伤时是必需的。然而，目前仍面临的一个挑战是如何确定这些蛋白质在复制过程中处理损伤的机制。in vivo. 以大肠杆菌为模型系统，我们描述了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定复制质粒上产生的结构中间体的实验方法in vivo在紫外线诱导的DNA损伤之后。该方法已被用于证明，由紫外线诱导的损伤所阻滞的复制叉会发生短暂的逆转，这种逆转由RecA及若干与RecF途径相关的基因产物共同稳定。该技术表明，这些复制中间体会持续存在，直至与核苷酸切除修复清除损伤位点的时间相吻合，随后DNA复制恢复。

方案

1. 生长与紫外照射。

1. 取200μl在DGCthy培养基（Davis培养基¹中添加0.4%葡萄糖、0.2%酪蛋白氨基酸和10 μg/ml胸腺嘧啶）中过夜培养并含有pBR322质粒的新鲜培养物，加入100 μg/ml氨苄青霉素，离心收集菌体。将菌体沉淀重悬于200μl不含氨苄青霉素的DGCthy培养基中，并用于接种20 ml DGCthy培养基。
2. 在37°C摇床培养箱中，将培养物在无氨苄青霉素选择压力下培养至OD₆₀₀为0.5（约5 × 10⁸ 个细胞/ml）。在无氨苄青霉素条件下培养可避免对某些突变体中可能出现的异常或无功能复制中间体产生选择性压力。此外，若使用紫外光诱导损伤，则必须从培养基中去除氨苄青霉素，因其在该波长范围内有强吸收，会屏蔽细胞，降低有效紫外剂量。
3. 在黄光灯下操作，将培养物置于直径15 cm的培养皿中，并放置于旋转平台上以保持搅动。将培养皿置于距离15瓦杀菌灯一定距离处，使照射强度约为1 J/m²/sec（使用UVC光度计测定），进行照射。培养物接受50 J/m²剂量照射后，立即放回37°C摇床培养箱中继续培养直至实验结束。该剂量平均在每4.5 kb单链DNA中产生1个环丁烷嘧啶二聚体。黄光照明可防止光复活——即光解酶介导的环丁烷嘧啶二聚体的修复。

2. DNA 提取

1. 当需要检测复制中间....

讨论

图1展示了在有无紫外线诱导损伤的情况下，从野生型细胞中获得的典型结果。在无损伤情况下，当细胞处于快速指数生长期时，总质粒DNA中约有1%存在于Y弧中。经照射后，随着复制叉在损伤位点处受阻并积累，Y形分子出现短暂增加。X形复制中间体也短暂积累，并持续存在，直至与损伤修复的时间点相对应。

可以使用塑料吸管将复制中间体从凝胶中 punched out（打孔取出），替代 Southern 杂交分析，经纯化后直接通过电子显微镜观察。我们已成功利用该方法鉴定出在复制叉遭遇 DNA 损伤时所需的关键基因产物，并鉴定了在这些突变体中积累的异常复制中间体。此外，该方法还可轻松改进以检测其他形式的 DNA 损伤。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2D 凝胶 Southern 杂交分析示例	GE Healthcare	G15T8	黄色照明灯
15 μwatt 杀菌灯	Sylvania	F20T12/GO	紫外灯
Blak-Ray 254 nm 紫外强度计	Daigger	EF28195T	UVC 光度计
0.025 μm 孔径透析盘	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	漂浮式透析盘
PvuII	Fermentas	ER0632	限制性内切酶
缺口平移试剂盒	Roche Group	976776	用于制备 32P 标记探针
吸水纸	Whatman, GE Healthcare	3030-704	用于 Southern 转印
尼龙膜	GE Healthcare	RPN203S	用于 Southern 转印