酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：针对微生物抗原的Th-1型细胞免疫反应的定量分析

摘要

利用酶联免疫斑点试验可实现对特发性疾病中适应性免疫的微生物靶标进行鉴定。

摘要

适应性免疫在清除细胞内病原体过程中起着重要作用。在人体中检测和量化这些免疫应答的能力是一项重要的诊断工具。酶联免疫斑点试验（ELISPOT）因其能够识别针对微生物抗原的细胞免疫应答而日益受到关注，尤其适用于HIV感染、器官移植和使用类固醇等免疫功能低下的人群。该试验不仅能定量分析针对特定微生物抗原的免疫应答，还可区分这些应答属于Th1型还是Th2型。ELISPOT检测不受炎症部位限制，具有良好的灵活性，可用于评估外周血中的免疫应答，也可用于检测支气管肺泡灌洗液、脑脊液和腹水等存在活动性病变部位的免疫反应。该方法可检测针对单一或多種抗原的免疫应答，也可识别微生物蛋白内的特异性表位。ELISPOT有助于随时间动态监测免疫应答，并区分宿主T细胞所识别的抗原差异。双色ELISPOT检测技术可用于同时检测两种细胞因子的表达。该技术的最新应用包括肺外结核病的诊断，以及探究感染性抗原在自身免疫性疾病发生中的作用。

方案

在以下实验方案中，我们使用外周血单个核细胞（PBMC）作为目标细胞。然而，本方案也可适用于其他类型的细胞。请在组织培养超净台中使用无菌技术进行实验操作。

第1天：培养板与细胞的准备

1. 取出一块ELISPOT板，在生物安全柜中打开。
2. 使用多通道移液器（如有）每次加入150 μL的1×PBS，洗涤板孔3次；若无多通道移液器，可使用单通道移液器逐孔操作。
3. 取出一包储液槽，在生物安全柜中打开。
4. 将2 μg/mL的捕获抗体（抗人干扰素-γ）加入11 mL的1×PBS中，充分涡旋混匀，然后将抗体混合液转移至储液槽中。
5. 使用多通道移液器向每个孔中加入100 μL包被液。
6. 用封口膜包裹板子。
7. 将板子置于冰箱中过夜。包被后的板子可保存数周。经验法则是：若孔中仍有液体残留，则该板仍可使用。

细胞准备

如果PBMC为新鲜样本，则计数细胞并在37°C、5% CO₂条件下培养过夜。对于保存在液氮中的PBMC，需先进行细胞复苏。操作步骤如下：

1. 将冻存细胞在37°C水浴中解....

讨论

ELISPOT 检测已成为监测人类及多种其他物种免疫反应最重要且应用最广泛的检测方法之一。通过 ELISPOT 检测，可在无需扩增或操纵细胞群体的情况下，以单细胞水平测定免疫细胞的频率。该检测已广泛应用于研究感染、癌症、过敏及自身免疫性疾病等多种疾病中的抗原特异性免疫反应。该技术主要应用于需要精确定量抗原特异性细胞，或比较不同疾病状态下针对特定抗原的免疫反应的研究，例如结核病在抗生素治疗前后的免疫反应分析 ¹然而，最近的报道表明，该检测方法可用于检测从腹水、脑脊液或支气管肺泡灌洗液等分离的细胞样本中抗原特异性T细胞的频率。Sung-Han Kim 等人已证实，对疑似腹腔结核患者外周血单个核细胞（PBMCs）进行ELISPOT检测时，诊断活动性腹腔结核的敏感性可达89% ²此外，已有研究表明，基于T细胞的ELISPOT检测在使用外周血和脑脊液单个核细胞诊断疑似结核性中枢神经系统受累的活动性结核病患者时，敏感性达到91% ³我们的实验室利用ELISPOT检测法评估结节病患者外周血单个核细胞（PBMC）对分枝杆菌抗原ESAT-6的细胞识别能力。本报告具有重要意义，因为它表明EL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 培养基的制备
B. Tris 缓冲液的制备
向 1 L 烧杯中加入 800 ml 去离子水（ddH2O）。 称取 12 克 Tris 并加入烧杯中。 向烧杯中加入 0.12 克六水合氯化镁（MgCl2:6H2O）。 使用磁力搅拌棒在自动搅拌板上搅拌。 待完全溶解后，将溶液 pH 调至 9.5。 向烧杯中加入 200 mL 去离子水（ddH2O），定容至 1000 mL。 使用 0.22 μm 滤膜过滤溶液。
C. ELISPOT 分析所需材料：