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方法文章

酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：针对微生物抗原的Th-1型细胞免疫反应的定量分析

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DOI：

10.3791/2221

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2010年11月23日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用酶联免疫斑点试验可实现对特发性疾病中适应性免疫的微生物靶标进行鉴定。

摘要

适应性免疫在清除细胞内病原体过程中起着重要作用。在人体中检测和量化这些免疫应答的能力是一项重要的诊断工具。酶联免疫斑点试验（ELISPOT）因其能够识别针对微生物抗原的细胞免疫应答而日益受到关注，尤其适用于HIV感染、器官移植和使用类固醇等免疫功能低下的人群。该试验不仅能定量分析针对特定微生物抗原的免疫应答，还可区分这些应答属于Th1型还是Th2型。ELISPOT检测不受炎症部位限制，具有良好的灵活性，可用于评估外周血中的免疫应答，也可用于检测支气管肺泡灌洗液、脑脊液和腹水等存在活动性病变部位的免疫反应。该方法可检测针对单一或多種抗原的免疫应答，也可识别微生物蛋白内的特异性表位。ELISPOT有助于随时间动态监测免疫应答，并区分宿主T细胞所识别的抗原差异。双色ELISPOT检测技术可用于同时检测两种细胞因子的表达。该技术的最新应用包括肺外结核病的诊断，以及探究感染性抗原在自身免疫性疾病发生中的作用。

方案

在以下实验方案中，我们使用外周血单个核细胞（PBMC）作为目标细胞。然而，本方案也可适用于其他类型的细胞。请在组织培养超净台中使用无菌技术进行实验操作。

第1天：培养板与细胞的准备

  1. 取出一块ELISPOT板，在生物安全柜中打开。
  2. 使用多通道移液器（如有）每次加入150 μL的1×PBS，洗涤板孔3次；若无多通道移液器，可使用单通道移液器逐孔操作。
  3. 取出一包储液槽，在生物安全柜中打开。
  4. 将2 μg/mL的捕获抗体（抗人干扰素-γ）加入11 mL的1×PBS中，充分涡旋混匀，然后将抗体混合液转移至储液槽中。
  5. 使用多通道移液器向每个孔中加入100 μL包被液。
  6. 用封口膜包裹板子。
  7. 将板子置于冰箱中过夜。包被后的板子可保存数周。经验法则是：若孔中仍有液体残留，则该板仍可使用。

细胞准备

如果PBMC为新鲜样本，则计数细胞并在37°C、5% CO2条件下培养过夜。对于保存在液氮中的PBMC，需先进行细胞复苏。操作步骤如下：

  1. 将冻存细胞在37°C水浴中解冻，直至几乎完全融化。
  2. 立即用5 mL R10培养基重悬细胞。
  3. 以225 × g离心5分钟。
  4. 再次用5 mL R10培养基重悬细胞，并使用台盼蓝计数活细胞。
  5. 用R10培养基将细胞浓度调整至2 × 106 个细胞/mL。
  6. 在37°C、5% CO2条件下静置过夜。

第2天：准备培养板

  1. 用样本编号、孔内条件和日期标记板盖。
  2. 使用倾倒和吸干法，用150 μL无菌1x PBS洗涤板6次。倾倒时注意不要溅出，否则可能导致板孔变为紫色。
  3. 向每个孔中加入100 μL R20。
  4. 在37°C孵育1小时。
  5. 孵育期间，计数过夜静置的细胞。
  6. 将细胞悬液在1500 rpm下离心5分钟。弃去上清液，并重悬沉淀，使最终浓度为每1 mL R10培养基中含有1×106个细胞。
  7. 1小时孵育结束后，使用倾倒和吸干法去除R20。倾倒时注意不要溅出。
  8. 向每个孔中加入100 μL细胞溶液（含105个细胞）。将相应的肽段和/或抗原以复孔形式加入对应孔中。每次吸取肽工作液时均需使用新的移液器吸头。常规肽段浓度为10–40 μg/mL。由于肽段性质各异，每位研究者应进行滴定以获得最佳结果。
  9. 在阴性对照孔中，仅加入细胞（不加肽段）。
  10. 在阳性对照孔中，加入植物血凝素（PHA；10 μg/mL；Sigma）。
  11. 在37°C、5% CO2条件下孵育过夜（约18小时）。

第3天：培养平板

  1. 用缓冲液洗涤平板 6 次 150 μL 使用倾倒和吸水法进行1xPBS处理。
  2. 添加 100 μL 使用多通道移液器向板的每孔加入 PBS。
  3. 将培养皿放入冰箱冷藏15分钟。
  4. 将培养板从冰箱中取出，放入组织培养超净台中。
  5. 制备生物素标记的抗体溶液
    • 添加 0.5 μg/mL 生物素抗体（mAB 7-B6-1）加入至 11 mL PBS 中。
    • 涡旋振荡溶液以充分混匀。
    • 若计划使用多通道移液器添加该溶液，应将其倒入试剂槽中。
  6. 弃去 PBS，将其弹入废液桶中。倾倒时注意不要溅出。
  7. 位置 100 μL 将溶液加入每个孔中。
  8. 将培养板置于超净工作台中，室温孵育1小时。
  9. 用 PBS 洗涤 6 次 150μL 1x PBS，采用倾去及吸印法。在第6th 洗涤，将 PBS 保留在板上，直至准备好链霉亲和素抗体。
  10. 制备链霉亲和素抗体。
    • 添加 5.5 μ l 链霉亲和素抗体（Streptavidin-ALP）按1:2000比例加入11 mL PBS中。
    • 涡旋振荡溶液以充分混匀。
    • 若计划使用多通道移液器加入该溶液，需先将其倒入储液槽中。
  11. 弃去孔中残留的 PBS，并将酶标板拍干。
  12. 添加 100 μL 向每个孔中加入链霉亲和素溶液。
  13. 将培养板置于超净工作台中，室温孵育1小时。
  14. 用 PBS 采用倾去和吸干法洗涤平板 6 次。在第 6 次th 洗涤，将 PBS 保留在板上，直到配制好显色溶液。
  15. 在暗处操作。配制碱性磷酸酶底物溶液（碱性磷酸酶底物试剂盒 IV BCIP/NBT）：
    • 向11 mL Tris缓冲液中加入4滴底物试剂1，充分涡旋混匀。向Tris缓冲液中加入4滴底物试剂2，充分涡旋混匀。向Tris缓冲液中加入4滴底物试剂3，充分涡旋混匀。
  16. 弃去剩余的 PBS，并将培养板吸干。
  17. 添加 100 μL 使用多通道移液器将显色液加入到板的每个孔中。
  18. 显色5到10分钟后打开光源。
  19. 让显色试剂在板上保留至斑点开始变为紫色且颜色较深为止。此过程通常需要5到20分钟。注意不要让底物溶液作用时间过长，以免导致背景过高。
  20. 用自来水清洗ELISPOT板3次。
  21. 静置干燥约一小时或过夜。
  22. 使用ELISPOT酶标仪或人工读取酶标板结果。
  23. 将培养板置于避光的盒子中存放。

代表性结果：

ELISPOT 旨在定量检测针对微生物抗原的免疫应答。每个斑点代表一个表达目标细胞因子的反应性细胞。斑点可通过人工计数或使用 ELISPOT 板式读数仪进行计数。

应首先通过阴性对照评估细胞因子本底产生情况，以判断ELISPOT实验是否操作正确。在阴性对照孔中，预期应无可见斑点，尽管可能存在少量本底（紫色）。通常情况下，每孔平均斑点数应少于5个。阳性对照孔用于确认反应操作正确，并验证细胞对抗原刺激具有应答能力。在阳性对照孔中，由于斑点融合，预期可见深紫色背景（图1），白色背景应极少或无。若阳性对照与阴性对照结果均符合预期，则可对含有目标抗原的孔进行斑点计数。若出现“次优”结果，则表现为高本底（孔呈紫色）、无斑点或斑点极少、孔中心空白、斑点轮廓不清或斑点融合。本文提供了一份故障排查建议列表（表1）。

ELISPOT 检测结果；免疫学实验；紫色斑点表示分泌细胞因子的细胞。
图 1. ELISPOT 板的代表性结果。每块板应至少设置两个孔的阳性对照、阴性对照以及待测肽段。C9、C10、D9 和 D10 为阳性对照孔，可见深紫色、细胞融合生长，且白色背景几乎不可见。阴性对照孔为 G11、G12、H11 和 H12，这些孔中无紫色背景，也无斑点，符合预期。G7、G8、H7 和 H8 孔中的斑点显示了细胞对微生物肽段的反应；每个紫色斑点代表一个表达目标细胞因子的单个反应性细胞。

表1

观察现象 可能的问题 可能的解决方案
背景过高1. 膜的两面未充分洗涤
2. 分泌细胞因子的细胞过多
3. 板未充分干燥
4. 显色时间过长		1. 在显色前后均用蒸馏水彻底洗涤膜的两面。试剂可能渗过膜进入板底，若未洗净会导致背景过高。
2. 减少每孔中的细胞数量，需进行优化
3. 在读板前延长干燥时间
4. 缩短显色时间
无斑点/斑点极少1. 分泌目标细胞因子/蛋白的细胞不足
2. 确保细胞受到正确刺激
3. 细胞孵育时间不足，或响应刺激物需要更长时间
4. 显色不充分
5. 一抗或二抗量不足		1. 增加每孔细胞数量，需进行优化
2. 使用阳性刺激对照——使用已知可诱导目标细胞因子/蛋白表达的刺激物
3. 延长细胞孵育时间，或采用间接方法（预先用刺激物处理细胞）
4. 使用体视显微镜监测显色过程，并确保显色试剂储存得当，未失活
5. 需提高一抗和/或二抗的浓度，需进行优化
空白区域1. 膜未预处理
2. 膜在某个阶段干燥
3. 细胞分布不均		1. 确保膜已用70%乙醇充分预处理（并非所有膜都需要此步骤，请咨询供应商）。之后用PBS充分洗涤3次
2. 确保膜在操作过程中不干燥
3. 加样前轻柔混匀细胞，确保形成均匀的细胞悬液
中心空白1. 洗涤过程中造成损伤1. 自动洗板机（或移液操作）的流速可能过高，需采用更温和的洗涤程序
假阳性1. 二抗发生聚集
2. 膜上残留细胞
3. 细胞培养污染		1. 对二抗进行过滤
2. 在加入二抗前，确保用含Tween 20的PBS彻底洗去膜上的所有细胞。残留细胞会导致形状不规则的斑点
3. 尽量保持试剂无菌和清洁，确保细胞培养操作无菌。通过设置培养基阴性对照来检测假阳性。关于板移动问题，参见斑点轮廓不清
斑点融合1. 包被效果差，抗体过多
2. 细胞培养时间过长
3. 细胞过度刺激		1. 降低一抗浓度
2. 细胞孵育时间越长，分泌的细胞因子/蛋白越多，导致斑点变大并开始融合，难以区分
3. 缩短细胞培养步骤的孵育时间。过度刺激会导致细胞分泌大量细胞因子/蛋白，形成融合且难以区分的斑点。可减少培养基中刺激物的用量，或缩短培养时间
斑点轮廓不清1. 膜未预处理（若您的膜需要此步骤，请咨询供应商）
2. 细胞孵育期间板发生移动		1. 膜必须用乙醇预处理，否则可能导致斑点模糊、轮廓不清，读板时难以识别
2. 细胞孵育期间避免板移动，移动的细胞可能形成多个斑点。如有可能，使用专用孵育箱，孵育期间不开启。加样后切勿敲击板
阳性对照孔信号弱1. 显色不充分——可能由于Streptavidin-ALP和/或BCIP/NBT溶液未恢复至室温所致1. 在加入孔板前将试剂恢复至室温
斑点密度过高，难以定量1. 每孔加入的细胞过多1. 对细胞进行梯度稀释（例如每孔1 × 106、5 × 105、1 × 105、5 × 104、1 × 104个细胞），以确定可形成清晰可辨斑点的最佳细胞数量

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讨论

ELISPOT 检测已成为监测人类及多种其他物种免疫反应最重要且应用最广泛的检测方法之一。通过 ELISPOT 检测，可在无需扩增或操纵细胞群体的情况下，以单细胞水平测定免疫细胞的频率。该检测已广泛应用于研究感染、癌症、过敏及自身免疫性疾病等多种疾病中的抗原特异性免疫反应。该技术主要应用于需要精确定量抗原特异性细胞，或比较不同疾病状态下针对特定抗原的免疫反应的研究，例如结核病在抗生素治疗前后的免疫反应分析 1然而，最近的报道表明，该检测方法可用于检测从腹水、脑脊液或支气管肺泡灌洗液等分离的细胞样本中抗原特异性T细胞的频率。Sung-Han Kim 等人已证实，对疑似腹腔结核患者外周血单个核细胞（PBMCs）进行ELISPOT检测时，诊断活动性腹腔结核的敏感性可达89% 2此外，已有研究表明，基于T细胞的ELISPOT检测在使用外周血和脑脊液单个核细胞诊断疑似结核性中枢神经系统受累的活动性结核病患者时，敏感性达到91% 3我们的实验室利用ELISPOT检测法评估结节病患者外周血单个核细胞（PBMC）对分枝杆菌抗原ESAT-6的细胞识别能力。本报告具有重要意义，因为它表明EL...

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致谢

部分由美国国立卫生研究院国家研究资源中心资助，项目编号为范德堡临床与转化科学奖 1 UL1 RR024975。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R01 HL 83839 和 R01 AI 65744 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

A. 培养基的制备

figure-materials-1

B. Tris 缓冲液的制备

  1. 向 1 L 烧杯中加入 800 ml 去离子水（ddH2O）。
  2. 称取 12 克 Tris 并加入烧杯中。
  3. 向烧杯中加入 0.12 克六水合氯化镁（MgCl2:6H2O）。
  4. 使用磁力搅拌棒在自动搅拌板上搅拌。
  5. 待完全溶解后，将溶液 pH 调至 9.5。
  6. 向烧杯中加入 200 mL 去离子水（ddH2O），定容至 1000 mL。
  7. 使用 0.22 μm 滤膜过滤溶液。

C. ELISPOT 分析所需材料：

figure-materials-2

参考文献

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