妇科肿瘤术中前哨淋巴结多光谱实时荧光成像检测

摘要

荧光成像是一种在肿瘤外科手术中具有前景的创新性影像引导手术技术。本视频中，我们介绍了在妇科肿瘤学领域应用荧光成像技术检测前哨淋巴结的技术操作流程。该方法采用多光谱荧光相机系统，并结合荧光造影剂吲哚菁绿（indocyanine green）进行实施。

摘要

几乎所有实体瘤的预后均取决于是否存在淋巴结转移^1-3。外科治疗通常将肿瘤的根治性切除与肿瘤引流区域的完全淋巴结清扫术相结合。然而，淋巴结切除会因感染、伤口裂开和淋巴水肿而导致并发症发生率升高^4,5。作为一种替代方法，前哨淋巴结活检术（SLN）在数十年前被开发出来，用于检测肿瘤引流区域的第一个淋巴结⁶。在发生淋巴道转移的情况下，前哨淋巴结是首个受累的淋巴结（图1）。因此，若前哨淋巴结未发现转移灶，则远端淋巴结也应无肿瘤转移，无需予以切除。前哨淋巴结活检术目前已成为多种肿瘤类型治疗的一部分，如乳腺癌和黑色素瘤，也适用于外阴癌和宫颈癌的治疗⁷。当前前哨淋巴结检测的标准方法是在术前一日于肿瘤周围注射放射性胶体，并在术中注射染色剂。然而，该方法在宫颈癌和外阴癌中的缺点包括在生殖器区域进行多次注射，从而增加患者的心理负担，以及需要使用放射性胶体。

多光谱荧光成像是近年来发展起来的一种新兴成像技术，可在术中应用，且无需注射放射性胶体。进行术中荧光成像需要两个组成部分：一种荧光剂和一套用于术中成像的定量光学系统。我们采用的荧光染料为吲哚菁绿（ICG）。ICG 已被使用数十年，用于评估心脏功能、脑灌注和肝灌注⁸。它是一种惰性药物，具有安全的药理学和生物学特性。当以约 750 nm 的光激发时，ICG 会在近红外光谱区约 800 nm 处发射荧光。本研究使用了一套定制的多光谱荧光成像相机系统⁹。

本视频文章的目的是演示在宫颈癌和外阴癌患者中，使用术中荧光成像技术检测前哨淋巴结（SLN）的方法。荧光成像技术与标准方法联合使用，标准方法包括放射性胶体和蓝色染料。未来，术中荧光成像有望取代现有方法，并可便捷地拓展应用于其他适应证，如乳腺癌和黑色素瘤。

方案

1. 术中多光谱荧光相机

1. 该定制相机系统由德国慕尼黑工业大学/亥姆霍兹中心生物与医学影像研究所（IBMI, Technical University / Helmholtz Zentrum, Munich, Germany）与美国加州雷德伍德城SurgOptix公司（SurgOptix Inc, Redwood Shores, CA, USA）密切合作开发。术中多光谱荧光相机系统的装置如图2所示。
2. 光线通过光学系统后，被分离为可见光、发射（荧光）波长带的光和激发波长带的光。这些光束由CCD相机（CCD）检测（图2）。所有相机的多光谱信号经过处理，以校正伪影并获得真实的定量荧光染料生物分布。彩色图像和荧光信号可分别在外部显示器上显示，也可叠加为一幅图像。
3. 本研究中相机的激发滤光片和发射滤光片分别设置为采集750 nm和800 ±20 nm的光信号。

2. 光学对比剂的制备

1. 在无菌条件下配制荧光对比剂吲哚菁绿（ICG，Pulsion AG，德国慕尼黑）。使用浓度为 0.5 mg/mL。必须使用无菌蒸馏水而非氯化钠（NaCl）溶液，因为后者会导致 ICG 聚集。
2. 配制后，溶液必须保存在避光、阴凉处，以防止荧光强度因光漂白而迅速下降。注意：从此步骤开始，始终避免 ICG 暴露于光照下。

3. 术中成像——ICG 的设置与注射

1. 手术前，在手术室中对摄像头进行定位并启动，以尽量减少对标准手术流程的干扰，并将其连接至高清显示屏（图2B）。
2. 由穿戴无菌手术服的研究人员使用标准无菌罩单（Carl Zeiss Vision BV，荷兰斯利德雷赫特，OPMI Drape REF 306071）覆盖摄像头。
3. 注意：应仅使用透明的消毒剂，因为有色消毒剂通常具有自发荧光，可能干扰成像过程。此外，无菌罩单和手术标记物也可能具有自发荧光。建议在手术前测试手术室及手术区域中使用的所有材料是否具有自发荧光。
4. 在无菌条件下配制荧光造影剂吲哚菁绿（ICG），使用浓度为0.5 mg/mL。必须使用无菌蒸馏水而非氯化钠溶液（NaCl），因为后者会导致ICG聚集。配制完成后，溶液应储存在阴暗、低温处，以避免荧光强度快速衰减。注意：建议在配制ICG后更换手套，因为即使少量ICG溢出也可能影响图像质量。
5. 打开腹腔后开始成像操作。当目标区域暴露后，将摄像头移入手术区域。在无菌条件下调节变焦和对焦。关闭手术室内的照明灯，以更好地检测荧光信号。
6. 将1.0 mL浓度为0.5 mg/mL的ICG与1.0 mL标准蓝色染料（专利蓝 / bleu patenté，Guerbet，法国）混合于同一注射器中。外科医生在原发肿瘤周围的四个象限内注射造影剂，避免造影剂溢出。注意：若ICG溢出至手术手套上，必须更换手套。采集淋巴流动过程及荧光示踪淋巴结显影的静态图像或实时视频（图3）。所有图像和视频均直接保存至计算机。
7. 除荧光检测外，还根据标准方案通过γ探针或肉眼观察淋巴结是否染成蓝色，或同时采用两种方法来确认示踪淋巴结（SLN）。放射性示踪剂通常在手术前一天注射，随后进行淋巴显像以定位放射性示踪淋巴结。此步骤属于标准操作流程，不纳入荧光成像方案。
8. SLN的实时切除由荧光信号及淋巴结的蓝色染色共同引导。摄像头的实时成像功能有助于发现残留荧光或荧光淋巴结的意外定位。
9. 切除SLN后，对所有切除的淋巴结进行离体（ex vivo）成像，以检测是否存在荧光信号。拍摄静态图像时可延长曝光时间以获得更高分辨率（图4）。
10. 淋巴结的组织病理学检查可确定示踪淋巴结中是否存在肿瘤细胞。

4. 代表性结果

荧光淋巴结可被检测到，且具有较高的信噪比。此外，可监测吲哚菁绿（ICG）在淋巴管中的流动，从而实现淋巴结的实时定位成像。检测结果可能受淋巴结深度增加的影响，可能需要采用不同的照明方法以实现有效检测。未来，特异性靶向肿瘤的荧光探针的应用可能结合该技术，在术中实现对含有癌细胞的阳性前哨淋巴结的检测。

图1. 前哨淋巴结（SLN）理论。 SLN 是肿瘤引流区域的第一个淋巴结（或一组淋巴结）。

图2. 多光谱荧光相机系统的示意图（A）。手术室内相机系统的基本设置（B）。

图3. 外阴癌淋巴结的多光谱荧光成像 淋巴结的彩色图像 体内 (A). 同一淋巴结的荧光图像， 体内 （B）荧光伪彩图像与彩色图像叠加（C）。

图4. 淋巴结的多光谱荧光成像 离体 在宫颈癌中。 淋巴结的彩色图像 离体 (A). 同一淋巴结的荧光图像， 离体 （B）伪彩色荧光图像与彩色图像叠加（C）。

讨论

本视频演示了多光谱术中荧光成像技术在妇科肿瘤术中前哨淋巴结（SLN）检测中的应用。该方法相较于传统的SLN手术具有若干优势。注射在手术过程中、患者麻醉状态下进行，而非在手术前一日完成，对患者更为友好，尤其适用于妇科肿瘤患者。此外，术中成像可为外科医生提供淋巴流及其向SLN引流模式的直接视觉反馈，而非通过盖革计数器间接获取。在宫颈癌中，由于淋巴结位于盆腔深部，该技术可能有助于提高检出率。

然而，最重要的意义在于逐步推进的靶向成像方法。靶向荧光对比剂可与肿瘤特异性抗体或特异性作用于肿瘤细胞的底物相融合。通过这种方式，术中荧光成像有望彻底改变目前肿瘤外科手术的临床实践。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吲哚菁绿（ICG）	Pulsion Medical Systems AG, Munich, Germany	D-81829	使用蒸馏水配制的ICG溶液，而非0.9% NaCl溶液。
专利蓝 / Bleu patenté	Guerbet	12322784
注射用无菌水	B. Braun Medical
多光谱荧光相机系统	德国慕尼黑工业大学生物与医学成像研究所（IBMI）和美国SurgOptix公司	原型