慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

摘要

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）慢性炎症性疾病，多发于青壮年。其特征是在脑和脊髓中广泛分布的脱髓鞘区域及胶质细胞瘢痕形成。这些病灶会改变神经传导功能，导致不同程度的神经功能障碍，具体症状取决于中枢神经系统内脱髓鞘斑块的位置（例如轻瘫、瘫痪、失明、尿失禁）。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症（MS）的一种动物模型。EAE最初在人类中意外诱发，当时使用在兔脊髓上培养的病毒接种狂犬病疫苗，其中残留的脊髓组织与灭活病毒一同注射，从而引发了中枢神经系统疾病。基于这些观察，Rivers和Schwenther于1935年首次报道了用中枢神经系统匀浆免疫非人灵长类动物所建立的EAE模型。此后，EAE已在多种物种中成功建立，其病程表现因物种/品系及所使用的免疫原性抗原不同而有所差异。例如，用髓鞘碱性蛋白与佐剂乳化后免疫Lewis大鼠，可诱导出EAE的急性模型；而相同抗原在豚鼠中则引起慢性疾病。

本文所述的EAE模型是通过将DA大鼠脊髓在完全弗氏佐剂乳液中免疫DA大鼠而诱导产生的。免疫后7-14天内，大鼠会出现上升性弛缓性瘫痪。临床症状在数周内表现为复发-缓解病程。病理学显示中枢神经系统内存在大量免疫细胞浸润以及脱髓鞘斑块。视频末尾描述了EAE动物护理的特殊注意事项。

方案

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与监测

乳剂是将水溶液中的抗原与添加了补充物的完全弗氏佐剂按1:1比例混合而成。必须将抗原加入佐剂中，而不能反向操作！！！

制备和注射乳剂时会存在较多损耗。务必准备超出实际需求量1.5至2倍的量。

使用已灭菌的研钵、研杵、玻璃注射器和桥状工具。所有塑料制品应为无菌。该操作可在普通实验台上进行。

1. 补充佐剂的制备

称取 30 mg 的 结核分枝杆菌 （Difco 目录号 #231141）放入研钵中，研磨成细粉，注意不要用力过猛，以免破坏细菌。加入 10 ml 完全弗氏佐剂 H37Ra（Difco 目录号 #231131），混匀。此添加后的佐剂现含有 4 mg/ml 结核分枝杆菌转移至离心管中。

2. 脊髓匀浆的制备

取DA大鼠（年龄和性别不限）的脊髓，于-80°C冷冻保存。称取冷冻脊髓，确保有足够的量与添加佐剂按1:1（重量:体积）的比例混合。用剃刀将脊髓尽可能切碎，转移至第1节中使用的研钵中，用研杵研磨成糊状。

3. 乳液的制备

1. 将添加佐剂的完全弗氏佐剂放入试管中，高速涡旋振荡。在持续涡旋的同时，逐滴加入脊髓匀浆液。当全部脊髓匀浆液加完后，继续涡旋5分钟。混合物应变为淡粉色。
   
   
2. 将乳剂装入一支5 ml玻璃注射器中，并使用18G连接桥（Fisher目录号# 14-825-17L）连接另一支5 ml玻璃注射器。将乳剂在两支注射器之间反复推注，直至乳剂变稠（5–10分钟）。若制备的乳剂量超过5 ml，应使用多个5 ml注射器，切勿使用更大容量的注射器。
   
   
3. 乳剂可在注射器中于4°C保存3周。建议至少提前12小时制备，以检查其是否发生分层。乳剂应保持浓稠状态，不分离为两相。颜色将在过夜后变为浅黄色或米色。

4. 大鼠的免疫

1. 将乳剂在注射器中混合几分钟后，转移至用于注射的注射器中。使用23G针头和3 ml鲁尔锁型注射器，在短效麻醉下，于尾根部皮下注射200 µl。
   
   
2. 受体为7–9周龄的雌性DA大鼠。我们的大鼠购自Harlan-Sprague Dawley。
   
   
3. 应每天观察大鼠两次，并每日称重。注射乳剂后7–15天内可能出现临床症状。
   

临床评分：

0：无疾病

0.5：尾部远端松弛

1：尾巴无力

2：轻度截瘫，共济失调

3：轻度截瘫，大鼠偶尔会绊倒

3.5：一只后肢瘫痪，另一只后肢可以活动

4：完全性后肢瘫痪

5：完全性后肢瘫痪及大小便失禁

6：濒死状态，呼吸困难，不进食也不饮水。应立即实施安乐死。

讨论

本方案有几个重要的注意事项。

DA 大鼠的遗传背景会因购买的供应商不同而略有差异。这些差异可能增加或降低大鼠对 EAE 诱导的易感性。如果您的大鼠对 EAE 更为易感，您可以通过使用未添加佐剂的完全弗氏佐剂，甚至不完全弗氏佐剂，来降低免疫强度。您也可以考虑减少注射乳剂的用量，或在制备乳剂前用生理盐水稀释脊髓匀浆。如果使用全效免疫乳剂后大鼠仍未出现 EAE 的临床症状，请检查饲养环境的清洁程度。感染寄生虫（如蛲虫）的大鼠将不会发生 EAE。您可以考虑在更洁净的条件下饲养动物，例如使用高压灭菌的笼具并配备滤帽，并自由提供酸化水（酸化水的制备方案附后）。

乳剂必须是水包油型，以便佐剂中的油能够完全包裹住逐滴加入的抗原。相反方式制备的乳剂（油包水型）虽然也会变得很粘稠，但不会引起脑炎反应。

如果大鼠已适应操作者，它们通常是温顺的动物，因此在注射致脑炎性乳剂前，每天温和地接触它们是一个很好的做法。这将减少大鼠的应激反应和咬伤风险。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂’佐剂	试剂	Fisher Scientific	DF 311-360-5	由 Difco 生产
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	试剂	Fisher Scientific	DF3114-33-8	由 Difco 生产
DA 大鼠	动物	Harlan Laboratories		雌性，7–9 周龄。
5 ml玻璃注射器	工具	Fisher Scientific	14-823-10 B
金属桥 - 18G	工具	Fisher Scientific	14-825-17L
3 ml 鲁尔锁塑料注射器	工具	BD 生物科学	309585
针头 - 20G 1 1/2	工具	Fisher Scientific	14-826-5C