大规模基于斑马鱼的体内小分子筛选

摘要

斑马鱼已成为基于表型的药物筛选和化学遗传学分析的强大体内研究平台。本文中，我们展示了一种利用斑马鱼胚胎进行小分子大规模筛选的简单、实用的方法。

摘要

鉴于其胚胎体积小、发育迅速、身体透明、繁殖力强，以及在分子、形态和生理方面与哺乳动物存在诸多相似性，斑马鱼已成为一种强大的in vivo基于表型的药物筛选和化学遗传学分析平台。在此，我们展示了一种利用斑马鱼胚胎进行小分子大规模筛选的简单且实用的方法。

方案

1）斑马鱼卵收集

1. 在化学筛选前一天下午，准备10至20个斑马鱼繁殖缸。每个缸中加入养殖系统中的水。使用鱼网将一条成年雄鱼和一至两条成年雌鱼转移到每个繁殖缸的内槽中。用隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。标记各个繁殖缸，并盖上盖子。
2. 在筛选当天早晨，移除繁殖缸中的隔板，使斑马鱼交配。在接下来的1小时内，让受精卵通过每个内槽底部的网格自然落下。
3. 1小时后，将成年斑马鱼放回永久饲养缸，取出内槽，并通过塑料茶滤网过滤每个繁殖缸中的水来收集卵。
4. 将滤网倒置在培养皿上方，使用装有E3培养基的洗瓶轻轻冲洗滤网，使卵被冲入培养皿中。
5. 应使用一次性塑料移液器去除所有不透明的未受精卵。每次交配组合应获得约200个胚胎。

2）将胚胎排列在96孔板中

1. 使用玻璃巴斯德吸管将约5个胚胎转移至96孔板的每个孔中，孔内预先加入E3培养基。
2. 当胚胎排列至96孔板后，使用12通道移液器（30 - 300 μL）尽可能吸除各孔中的E3培养基，注意避免刺破胚胎。随后立即使用同一12通道移液器向每孔快速加入250 μL含有0.5 μg/mL卡那霉素的E3培养基，以防止胚胎干燥。
3. 将96孔板放入28.5°C培养箱中孵育，直至胚胎发育至需要添加化合物的特定阶段。

3）小分子文库的转....

讨论

在规划基于斑马鱼的化学筛选实验时，必须特别关注所考察表型的稳健性及其背景发生率。这一点对于筛选能够抑制诱导性表型的化学物质尤为重要。例如，若表型由热激诱导转基因表达引起，则必须在启动筛选前精确确定能够稳定诱导该表型的实验条件，以避免假阳性率过高。通过周密的规划，斑马鱼化学筛选实验（所需资金投入适中）有望发现新的细胞信号转导和生理功能调节剂，以及可用于逆转人类疾病模型的先导化合物。最后，类比经典的正向遗传学筛选，基于斑马鱼的化学筛选在化学遗传学解析基本生物学过程方面也具有重要价值。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称	类型	公司	目录编号
至少20对具有目标基因型的成年斑马鱼。
鱼网、繁殖缸（带可拆卸内槽和隔板，Aquatic Habitats）。
培养皿（10 cm）。
塑料茶漏。
装有胚胎用水的洗瓶。
一次性聚乙烯移液管。
聚苯乙烯96孔圆底检测板（Corning COSTAR；Lowell，MA）。
玻璃巴斯德移液管（Fisher Scientific）。
手动移液器泵，10 mL（Bel-Art Products，Pequannock，NJ）。
E3胚胎培养基：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4，含0.003% PTU（苯硫脲，Sigma；St. Louis，MO）。PTU可配制成10倍浓度溶液，即将0.3 g PTU溶解于1 L E3胚胎培养基中。含PTU的溶液应使用铝箔包裹以避光保存。
12通道移液器，2–20 μL（Eppendorf）。
12通道移液器，3–300 μL（Eppendorf）。
一次性聚苯乙烯移液管接液槽，50 mL（Fisher Scientific）。
结构多样小分子化合物库，以96孔板形式排列，DMSO中储存浓度为10 mM。每块母板分装至96孔聚丙烯储存板（Corning）中，并于-80°C保存直至使用。
96孔板用铝封膜（Nunc，Rochester，NY）。
DMSO（Sigma，St. Louis，MO）。
基础培养箱，28.5°C（Fisher Scientific）。
配备透射光源底座的体视显微镜（Leica Microsystems，Bannockburn，IL）。