使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus oocytes注射信使RNA来表达BK通道。膜片钳记录过程中，细胞内溶液由灌流系统控制。
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摘要
摘要
本文所述方案旨在研究大电导、电压门控及钙激活钾通道（BK通道）的激活机制。该方法通过膜片钳技术记录单个通道或全细胞电流，以分析通道在不同膜电位和胞内钙浓度条件下的开放特性。首先，将表达目标通道蛋白的细胞固定于记录槽中，并使用含适当离子成分的灌流液维持生理环境。随后，通过移液管形成高阻封接，并根据实验需求采用细胞贴附或全细胞记录模式。在记录过程中，施加阶梯式电压脉冲以评估电压依赖性激活，并同步调控灌流液中的Ca²⁺浓度，以探究钙离子对通道活性的调节作用。采集的电流信号经放大、滤波后由数据采集系统储存，并利用专用软件进行离线分析，包括电流-电压关系曲线绘制、激活曲线拟合及动力学参数计算。本方案可系统地揭示BK通道在电压与钙双重调控下的门控行为，适用于通道突变体功能研究及药理学评估。 关键词：BK通道，膜片钳技术，电压门控，钙激活，离子通道功能分析，电生理记录，通道门控行为2+激活的K+ （BK）通道。该方案也可用于研究其他离子通道和神经递质受体的结构-功能关系1BK通道在不同组织中广泛表达，参与多种生理功能，包括调控平滑肌收缩、内毛细胞的频率调谐以及神经递质释放的调节2-6BK通道由膜去极化和细胞内Ca²⁺激活2+ 和 Mg2+ 6-9因此，本方案旨在同时控制膜电压和细胞内溶液。在本方案中，将编码BK通道的信使RNA注入 非洲爪蟾 V-VI期卵母细胞，随后在18°C下培养2-5天10-13采用膜片钳技术，以细胞内侧朝外构型分离出含有单个或多个BK通道的膜片10-13记录过程中，用所需溶液灌流膜片的胞内侧，以检测不同条件下通道的激活情况。综上所述，将BK通道的mRNA注入 非洲爪蟾 卵母细胞用于在卵母细胞膜上表达通道蛋白；采用膜片钳技术，在受控的电压和细胞内溶液条件下记录通过通道的电流。
方案
1. 将 mRNA 注射到卵母细胞中
- 注射0.05 - 50 ng体外转录的信使RNA 体外 进入 Xenopus laevis 使用 Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific Company，型号 3-000-204）对卵母细胞（V–VI 期）进行显微注射，每种 mRNA 重复注射约十二个卵母细胞。
- 用ND-96溶液（96 mM氯化钠（NaCl，Mr 58.44 g/mol），2 mM氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），1.8 mM氯化钙（CaCl2•2H2O，Mr 147.02），1 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2.5 mM 丙酮酸钠（Mr 110.04 g/mol）和1×青霉素-链霉素，调pH至7.6，然后置于培养板中，在培养箱中孵育 18°C 超过 2 天。
2. 准备灌注系统
Automate ValveLink 16 灌流系统的示意图。该灌流系统利用加压氮气将灌流液从溶液储液罐中推出，流经灌流管路，最终到达灌流笔和灌流尖端。每一路灌流液的流动均由一个储液罐阀门和一个电子阀门共同控制。在本实验方案中，其中一个储液罐未加压，同时作为废液收集器和泄压装置。（图片改编自厂商网站 http://www.autom8.com）
- 将管路连接至灌流笔。打开电子阀控制器并开启电子阀。
- 为确保管路和灌流笔无堵塞和气泡，使用装有去离子水的注射器将去离子水推过每根管路。
- 将管路连接至溶液储液罐，并打开氮气瓶阀门以通入加压氮气。
- 打开储液罐阀门，使储液溶液充满管路。如有需要，轻弹储液罐阀门以去除溶液中的气泡。管路充满溶液后，关闭阀门。
- 用水填充灌注头，然后将其拧到灌注笔上。连接灌注头时注意避免产生气泡。
- 使用油泥将灌流笔固定在浴槽台上，确保灌流尖端位于浴槽空间内。灌流系统现已安装完毕。
- 向浴槽中加入去离子水，确保灌流尖端浸没在水中。
- 测试每种灌流液是否从灌流尖端正常流出。关闭连接至废液收集管的电子阀，依次打开一种灌流液的阀门（140 mM 氢氧化钾（KOH, Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），1 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA，Mr 380.35 g/mol），使用甲基磺酸（MeSO₃H）调节 pH 至 7.1–7.23，Mr 96.1 g/mol），Ca2+ 或根据需要将 Mg²⁺ 添加至所需浓度）。在显微镜下观察灌流液从灌流尖端流出的液流。关闭灌流液阀门，打开废液收集器阀门，此时灌流液流应几乎消失。对所有灌流液重复此测试。
- 当确认所有灌流液均能正常流动后，将浴槽中的去离子水替换为浴液（140 mM 氢氧化钾（KOH，Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），用甲磺酸（MeSO₃H）调节 pH 至 7.1–7.23，Mr 96.1 g/mol)
3. 膜片钳技术
- 每次进行膜片钳实验前，需用氯化银重新涂覆银记录电极。首先，将电极导线从移液管支架中取出，并将电极导线的尖端一半浸入装有新鲜次氯酸钠溶液的小瓶中，至少浸泡15分钟。此步骤可在导线上沉积一层氯化银。
- 用去离子水冲洗电极导线，然后用吸水纸轻轻吸干。随后将银/氯化银电极重新安装回移液管支架中。
- 将浴槽（参考）电极连接至放大器探头，并将其放入浴液中。此操作为记录电极做好准备。
- 现在准备数据采集。打开计算机，并将硬件密钥插入计算机的打印机端口。必须插入硬件密钥才能使用数据采集软件HEKA Pulse。
- 打开放大器（Axon Instruments，AXOPATCH 200B），并启动HEKA Pulse软件。加载实验协议文件，并调整配置设置，例如刺激量程。调整配置设置的目标是确保测试电位与指令电位完全一致。此步骤为数据采集设备做好准备。
- 准备卵母细胞。将卵母细胞浸入剥离溶液中（200 mM N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG，Mr 195.22 g/mol），200 mM 天冬氨酸（无K+）（Mr 133.1 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），10 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA，Mr 380.35 g/mol），1 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），用氢氧化钠（NaOH，Mr 40.0 g/mol）调节pH至7.4），处理5–10分钟。该剥离溶液可使卵黄膜与质膜分离，从而便于去除卵黄膜。
- 使用两对镊子轻轻将卵黄膜从卵母细胞上剥离。去膜后的卵母细胞极为脆弱，因此应尽量减少移动。
- 注意避免使去膜后的卵母细胞暴露于空气或气泡中，使用装有足够溶液的玻璃移液管将卵母细胞转移至浴槽中。此操作为记录做好准备。
- 制备膜片移液管。将玻璃毛细管（VWR International，货号 # 53432-921）插入Sutter P-97 Flaming/Brown微管拉制仪中，拉制玻璃移液管。在显微镜下观察移液管，确定其尖端形状和开口直径。开口直径应为2–4微米。
- 为减少记录过程中的电容电流并确保尖端光滑，需用石蜡涂覆尖端，然后进行火焰抛光。
- 将移液管尖端浸入移液管溶液（140 mM 氢氧化钾（KOH，Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），2 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），用甲磺酸（MeSO3，Mr 96.1 g/mol）调节pH至7.1–7.2）中，通过抽吸活塞使溶液进入尖端。此操作可润湿尖端。
- 使用注射器将移液管溶液填充至移液管约三分之一处，并将移液管放入移液管支架中，确保内部的银/氯化银电极与移液管溶液接触。此操作完成膜片移液管的准备。
- 为从已准备好的卵母细胞上切取内面向外膜片，需在显微镜下找到卵母细胞的清晰边缘。使用操纵器将膜片移液管移近卵母细胞。记录移液管的串联电阻。当移液管充满移液管溶液并浸入浴液中时，理想的串联电阻应在1–1.5 MΩ之间。
- 缓慢将移液管推向卵母细胞，直至电阻大约增加一倍。
- 通过连接至移液管支架的吸管用嘴施加轻微负压，直至形成吉欧姆级密封。通过在-30 mV电压下钳制数分钟使膜片稳定。
- 为获得内面向外膜片，需快速将移液管进一步推入卵母细胞，然后轻轻拉出，以切下膜片。
- 内面向外膜片现已准备好用于钳制。将持有该膜片的移液管移至灌流管尖端开口约100微米处。
- 关闭废液收集的电子阀，打开所需灌流溶液的储液阀。
- 开始记录跨膜电流。根据需要改变电压和灌流溶液。
- 记录完成后，通过推动去离子水冲洗灌流管路、笔状电极和尖端，以防止堵塞。
4. 典型结果
在进行膜片钳实验的卵母细胞制备过程中，使用剥离液处理5-10分钟可使卵黄膜与质膜分离，从而实现卵黄膜的剥离。
当灌注电极内液并浸入浴液中时，膜片钳电极的理想串联电阻应在1-1.5 MΩ之间。
以下是卵母细胞膜片上野生型BK通道的代表性记录。左上方的方波表示施加于膜片的电压——第二个电压阶跃从50 mV增加至200 mV，增幅为50 mV。下方为灌流液中名义上无Ca2+（游离[Ca2+]约为0.5 nM）时相应的电流轨迹。电流幅度的增加表明BK通道的开放概率随电压升高而增大。右侧显示在相同电压刺激下，同一膜片在灌流1.0 μM Ca2+时的记录结果。在相同电压下电流幅度进一步增大，表明通道开放概率也随[Ca2+]升高而增加。
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讨论
卵母细胞表达系统因其内源性离子通道背景信号相对较低，是进行电压门控离子通道电生理学表征的理想选择。此外，由于该系统属于瞬时表达系统，因此为开展这些通道的突变研究提供了高效的方法。然而需要注意的是，卵母细胞表达系统与哺乳动物细胞系统存在差异，因此在翻译后修饰以及与不同亚基的结合方面可能存在区别。此外，两种细胞间的脂质浓度可能存在差异，从而影响离子通道的功能特性。
每次实验后，应使用去离子水清洗灌流管路、笔形电极和探头，以防止堵塞。务必使用新鲜的漂白剂处理银电极丝，确保其表面被氯化银覆盖，否则记录结果将不准确。调整数据采集的配置设置，使测试电位与指令电位完全相等。保持膜片钳电极清洁有助于实验，因此应使用盖子保护其免受污染，并仅在使用前进行火焰抛光。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01-HL70393 和 R01-NS060706 的支持，资助对象为 J.C。J.C. 是斯宾塞·T·奥林教席资助下的生物医学工程教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nanoject II 自动纳升级注射器 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 灌流系统及电子控制器 | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | 灌流尖端内径：100 微米 |
| 倒置显微镜 | Olympus Corporation | CKX31 | |
| 玻璃移液管 | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 放大器 | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| 计算机接口 | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| 前置放大头级 | Axon Instruments | CV 203BU |
参考文献
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