使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus oocytes注射信使RNA来表达BK通道。膜片钳记录过程中，细胞内溶液由灌流系统控制。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述方案旨在研究大电导、电压门控及钙激活钾通道（BK通道）的激活机制。该方法通过膜片钳技术记录单个通道或全细胞电流，以分析通道在不同膜电位和胞内钙浓度条件下的开放特性。首先，将表达目标通道蛋白的细胞固定于记录槽中，并使用含适当离子成分的灌流液维持生理环境。随后，通过移液管形成高阻封接，并根据实验需求采用细胞贴附或全细胞记录模式。在记录过程中，施加阶梯式电压脉冲以评估电压依赖性激活，并同步调控灌流液中的Ca²⁺浓度，以探究钙离子对通道活性的调节作用。采集的电流信号经放大、滤波后由数据采集系统储存，并利用专用软件进行离线分析，包括电流-电压关系曲线绘制、激活曲线拟合及动力学参数计算。本方案可系统地揭示BK通道在电压与钙双重调控下的门控行为，适用于通道突变体功能研究及药理学评估。 关键词：BK通道，膜片钳技术，电压门控，钙激活，离子通道功能分析，电生理记录，通道门控行为2+激活的K+ （BK）通道。该方案也可用于研究其他离子通道和神经递质受体的结构-功能关系1BK通道在不同组织中广泛表达，参与多种生理功能，包括调控平滑肌收缩、内毛细胞的频率调谐以及神经递质释放的调节2-6BK通道由膜去极化和细胞内Ca²⁺激活2+ 和 Mg2+ 6-9因此，本方案旨在同时控制膜电压和细胞内溶液。在本方案中，将编码BK通道的信使RNA注入 非洲爪蟾 V-VI期卵母细胞，随后在18°C下培养2-5天10-13采用膜片钳技术，以细胞内侧朝外构型分离出含有单个或多个BK通道的膜片10-13记录过程中，用所需溶液灌流膜片的胞内侧，以检测不同条件下通道的激活情况。综上所述，将BK通道的mRNA注入 非洲爪蟾 卵母细胞用于在卵母细胞膜上表达通道蛋白；采用膜片钳技术，在受控的电压和细胞内溶液条件下记录通过通道的电流。
方案
1. 将 mRNA 注射到卵母细胞中
- 注射0.05 - 50 ng体外转录的信使RNA 体外 进入 Xenopus laevis 使用 Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific Company，型号 3-000-204）对卵母细胞（V–VI 期）进行显微注射，每种 mRNA 重复注射约十二个卵母细胞。
- 用ND-96溶液（96 mM氯化钠（NaCl，Mr 58.44 g/mol），2 mM氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），1.8 mM氯化钙（CaCl2•2H2O，Mr 147.02），1 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2.5 mM 丙酮酸钠（Mr 110.04 g/mol）和1×青霉素-链霉素，调pH至7.6，然后置于培养板中，在培养箱中孵育 18°C 超过 2 天。
2. 准备灌注系统
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讨论
卵母细胞表达系统因其内源性离子通道背景信号相对较低，是进行电压门控离子通道电生理学表征的理想选择。此外，由于该系统属于瞬时表达系统，因此为开展这些通道的突变研究提供了高效的方法。然而需要注意的是，卵母细胞表达系统与哺乳动物细胞系统存在差异，因此在翻译后修饰以及与不同亚基的结合方面可能存在区别。此外，两种细胞间的脂质浓度可能存在差异，从而影响离子通道的功能特性。
每次实验后，应使用去离子水清洗灌流管路、笔形电极和探头，以防止堵塞。务必使用新鲜的漂白剂处理银电极丝，确保其表面被氯化银覆盖，否则记录结果将不准确。调整数据采集的配置设置，使测试电位与指令电位完全相等。保持膜片钳电极清洁有助于实验，因此应使用盖子保护其免受污染，并仅在使用前进行火焰抛光。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01-HL70393 和 R01-NS060706 的支持，资助对象为 J.C。J.C. 是斯宾塞·T·奥林教席资助下的生物医学工程教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nanoject II 自动纳升级注射器 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 灌流系统及电子控制器 | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | 灌流尖端内径：100 微米 |
| 倒置显微镜 | Olympus Corporation | CKX31 | |
| 玻璃移液管 | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 放大器 | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| 计算机接口 | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| 前置放大头级 | Axon Instruments | CV 203BU |
参考文献
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y.
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